弓形蟲基因型分型研究新進(jìn)展※

●孫青松 王千尋 宮鳳穎 李沐森

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點實驗室 吉林 吉林 132109）

1 弓形蟲病病原學(xué)

弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的人獸共患寄生蟲，宿主類型廣泛[1]，包括家畜、家禽及野生動物，在犬、貓、鳥、魚等動物體內(nèi)均可寄生[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球約有1/3 人口感染弓形蟲，我國弓形蟲感染率達(dá)8%。中間宿主的感染主要通過3種途徑：一是食用被貓糞便中寄生蟲卵囊污染的食物或飲水，二是食用含弓形蟲包囊的生肉或半生的肉類，三是經(jīng)胎盤傳播給下一代[3]。孕婦感染弓形蟲可致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、畸胎甚至胎兒死亡。免疫功能低下或免疫缺陷者感染弓形蟲是導(dǎo)致死亡的一個主要原因[3]。

弓形蟲的蟲種只有1種，但不同宿主感染后，其致病性和敏感性卻有著很大差異。弓形蟲生長過程主要包括5種形態(tài)，在中間宿主體中有2種存在方式，分別是滋養(yǎng)體和包囊；在終末宿主體中則有3種存在方式，分別是裂殖體、配子體和卵囊。

弓形蟲具有80 Mb的基因組，其染色體數(shù)目為11 條?；蚪M的相似度較高，但其位點的多個基因存在多態(tài)性，所以在表型上弓形蟲存在顯著差異。SAG1 具有1634bp的基因全長，有單個開放閱讀框存在其中，不具有內(nèi)含子且為單拷貝，蟲體侵入宿主細(xì)胞后，P30 蛋白在編碼后嚴(yán)重影響毒力情況，免疫保護(hù)性和原性較高，是主要的表面抗原，一般用于疫苗開發(fā)和診斷技術(shù)的研發(fā)。SAG1的開放閱讀框具有前號肽、功能區(qū)和疏水區(qū)，編碼氨基酸數(shù)為336個，大小約為30KD，在原核表達(dá)過程中蛋白主要存在于包涵體中，沒有生物活性[4]。

SAG2 基因在速殖子中編碼P22 蛋白，是主要的弓形蟲表面抗原，考慮到該基因具有一定的差異性，將其分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3個基因型，并且在DNA序列上的相差水平僅為l%～2%，但在對鼠類的致病性上卻有較大差異[5]。SAG3 基因編碼一種表面抗原蛋白，表達(dá)于緩殖子、速殖子和孢子期，分子量大小為43 KD，其三級結(jié)構(gòu)與P30 蛋白相似，可能在弓形蟲黏附和侵入宿主細(xì)胞中發(fā)揮較為重要的作用[6]，然而在SAG3 基因其他功能領(lǐng)域中的研究還不夠全面，還需要我們進(jìn)行深入了解分析。弓形蟲的另一個必需功能蛋白是棒狀體蛋白，其來源于桿狀體。由于宿主個體被寄生蟲寄生，所以ROPl的免疫原性也相對較高。ROP2 在蟲體侵入宿主細(xì)胞的過程同樣也起著重要作用。ROP2 還具備誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生Ig A、Ig M、Ig G的能力，以及影響機(jī)體產(chǎn)生IFN-。

2 弓形蟲基因型分型研究進(jìn)展

2.1 弓形蟲基因分型的研究方法

人類對弓形蟲基因分型的研究始于1992年，Sibley根據(jù)來自五大洲的28株弓形蟲分離株在小鼠身上的毒力實驗，將對小鼠致病力不同的弓形蟲分為強毒株和弱毒株。之后，1995年由Daniel Howe和David Sibley對來自北美洲和歐洲的不同人和動物體內(nèi)的106 份弓形蟲分離株的基因型進(jìn)行分型，并首次提出了將弓形蟲株分為I型、II型和III型的經(jīng)典基因型分類法，這在弓形蟲株的基因型分型領(lǐng)域一度成為研究者的參考標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)基因型蟲株也由此確立。

2005 年之前，大多采用單個基因位點進(jìn)行基因型分型研究，單位點擴(kuò)增在基因分型中存在較大的誤差，使許多新的非典型基因型不能與標(biāo)準(zhǔn)型區(qū)分開來，之后隨著對不同地理區(qū)域的野生動物和人類患者體內(nèi)的弓形蟲分離株的基因分型研究，越來越多的重組型和非標(biāo)準(zhǔn)型基因型被發(fā)現(xiàn)，并且這些非典型的基因型表現(xiàn)出高頻率，這表明弓形蟲種群的總體多樣性可能會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于我們的預(yù)期。

在Howe等人的研究中，大多數(shù)的基因分型研究只是依靠幾個雙等位基因標(biāo)簽，在臨床樣品中弓形蟲的DNA含量較低時，其分辨率和辨別力也相當(dāng)?shù)?，同時由于選取的位點不同，不同實驗室的結(jié)果得出的結(jié)論也是不同的[7]。

對弓形蟲基因型分型研究的方法主要包括PCR-RFLP、多位點測序分型法（MLST）、微衛(wèi)星分型法、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、血清型分析法、內(nèi)含子測序分析法等。多位點測序分型法是對擴(kuò)增的特定DNA序列進(jìn)行測序來測定單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的方法，此種方法是建立在DNA序列的核酸多態(tài)性基礎(chǔ)之上的；微衛(wèi)星分型法是根據(jù)弓形蟲中微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)的差異所導(dǎo)致的DNA序列長度的多態(tài)性建立起來的；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA是在PCR基礎(chǔ)上對整個未知基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的技術(shù)；血清分型法是人工合成構(gòu)成弓形蟲抗原的一些肽類，由于這些肽類含有弓形蟲的多態(tài)性位點所編碼，所以僅需宿主的血清就可對弓形蟲進(jìn)行分型；內(nèi)含子測序分析法是對內(nèi)含子進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，對其進(jìn)行測序檢測內(nèi)含子序列中的單核酸多態(tài)性。在2006年，Su等發(fā)表了通過多位點的PCR-RFLP分子標(biāo)記對弓形蟲進(jìn)行基因型分型的方法[8]，這種方法簡便且分辨率高，逐漸成為弓形蟲基因型分型的主要方法。

2.2 弓形蟲基因型分型現(xiàn)狀

弓形蟲的基因型分型揭示了基因的多樣性，同時顯示弓形蟲有3個主要的無性系（I型、II型和III型），現(xiàn)在被分為6個主要演化支下的15個單倍群[9]。在法國，有關(guān)人類弓形蟲病的研究顯示，I型和II型蟲株具有突出的感染優(yōu)勢[10]。最近，對南美洲地區(qū)的人體和動物體中的弓形蟲研究表明了南美洲地區(qū)弓形蟲豐富的遺傳多態(tài)性[11-13]。在南美洲，免疫功能正常的弓形蟲病人常常顯示與非典型蟲株（非I型、II型或III型）的感染有關(guān)[14]。其他研究表明在中國的優(yōu)勢弓形蟲基因型為ToxoDB#9（也被稱為Chinese 1）[15]。而在非洲高度流行II型、III型、Africa1 和Africa3的基因型[16]。

近年來，有關(guān)豬的弓形蟲基因型分型表明葡萄牙、法國、日本和美國北部豬感染的弓形蟲基因型為在世界廣泛流行的I型、II型和III型，巴西東北部豬群之間流行的為6個弓形蟲的非典型性基因型[17]。

3 我國弓形蟲基因型分型研究進(jìn)展

我國弓形蟲的基因型分型研究起步較晚。對于動物感染弓形蟲株的基因型分型研究始于2007年，流行于中國豬群之間的弓形蟲的優(yōu)勢基因型為ToxoDB #9型，少數(shù)為ToxoDB #204型、ToxoDB #205型或ToxoDB #213型[18-20]。Dubey等在2007年首先采集了34只流浪貓的血清和糞便，采用凝集法檢測血清弓形蟲抗體，結(jié)果表明流浪貓的血清抗體陽性率高達(dá)79.4%；然后采集貓糞便的弓形蟲卵囊，并對17個分離蟲株10個位點進(jìn)行PCR-RFLP基因型分型，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個基因型，其中ToxoDB#9型占多數(shù)[1]。

另外在野生動物如麻雀、高原鼠兔和野鼠、家禽、流浪貓、家兔、家豬、市售豬肉、寵物犬以及人體內(nèi)均分離到了弓形蟲的蟲體[21]。近些年來國內(nèi)研究從219種動物及人體內(nèi)分離得到弓形蟲蟲株或者基因組，結(jié)果顯示共分離到12個基因型[1]。其中Chinese 1 基因型蟲株占所有分離株的66.36%，因此Chinese 1 為我國優(yōu)勢基因型，其次為Ⅰ型和Ⅱ型（變異型），這與非洲、北美洲和歐洲的原型克隆譜系差異很大[1]。

由此可見，通過對我國存在的弓形蟲調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國弓形蟲分離株具有有限的遺傳多態(tài)性，且Chinese1型為其優(yōu)勢基因型[1]。豬是人類感染弓形蟲病的重要來源，豬肉是中國居民最主要的肉食來源，因此豬源弓形蟲感染的研究顯得至關(guān)重要[1]。目前中國關(guān)于豬源弓形蟲的流行病學(xué)及基因型分型研究主要來自廣東、云南、安徽、貴州、江西、四川、重慶，東北地區(qū)僅有遼寧省的一次報道。另外弓形蟲對我國野生動物尤其是一些特種名貴的野生經(jīng)濟(jì)動物的感染，對其進(jìn)行調(diào)查和研究是十分重要和必要的。

4 展望

全球廣泛分布的弓形蟲基因型主要為I型、II型和III型，在小鼠體內(nèi)的毒力實驗表明I型為強毒株，II型為中等毒力株，III型為弱毒株，但因為基因型與相關(guān)蛋白的多態(tài)性密切相關(guān)，如致密顆粒和棒狀體，所以弓形蟲在小鼠和人體內(nèi)的致病性是不同的[22]。此外，每個地區(qū)感染弓形蟲的基因型和風(fēng)險因素不同，人化區(qū)域與野生區(qū)域弓形蟲發(fā)生基因互換的幾率也不同，導(dǎo)致不同基因型的致病力、藥物敏感性、感染力等有所差異[23]。

早期的研究表明，來源于歐洲和北美洲的剛地弓形蟲分離蟲株主要分成3個單克隆譜系，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，且最近的研究表明分布在歐洲、北美洲、非洲和亞洲地區(qū)的弓形蟲具有有限的基因多樣性，而分布于中美和南美地區(qū)的弓形蟲則具有豐富的多樣性基因型。對我國東南部、中部和西部地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國弓形蟲分離株具有有限的遺傳多態(tài)性，且Chinese1型為其優(yōu)勢基因型[24]。

弓形蟲的基因分型和遺傳多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)是近些年弓形蟲研究的重要進(jìn)展，具有重要的生物學(xué)意義和臨床意義。如通過對某地區(qū)弓形蟲病的流行分布及基因型進(jìn)行鑒定，對該地區(qū)弓形蟲遺傳多樣性進(jìn)行分析，不僅能為弓形蟲的遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)庫做補充，也為弓形蟲病針對性防控及公共衛(wèi)生問題的應(yīng)對提供理論參考。通過基因型可以掌握本地區(qū)流行于動物群之間的弓形蟲毒力和傳播途徑，并采取相應(yīng)的預(yù)防及治療措施，也可以為將來弓形蟲疫苗的研制提供基礎(chǔ)性支持。