超聲造影觀察小鼠兩種皮下移植瘤的血管生成?

李愛靜 林雪君 尹 玲 寇卜心 柴夢音 陳德喜 劉曉霓 孟繁坤

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京 100069)(2.北京市肝病研究所,北京 100069)

超聲在腫瘤血管生成的評價方面有重要應(yīng)用,尤其是超聲造影技術(shù),大大提高了腫瘤血管的顯示率。超聲造影所使用微泡造影劑的微泡大小均勻,可以對毛細(xì)血管的灌注進(jìn)行定量分析,評價腫瘤的微血管密度[1],目前臨床上常用的SonoVue,其微泡直徑與紅細(xì)胞大小相似,可以進(jìn)入腫瘤微血管,而無外溢,是一種對血管特定增強(qiáng)顯像的造影劑,從而可以對腫瘤血管進(jìn)行更好地顯像[2-3]。我們通過皮下注射建立BT-B膀胱癌細(xì)胞和Huh7肝癌細(xì)胞移植瘤小鼠模型,應(yīng)用高頻小動物超聲的二維灰階、彩色多普勒和超聲造影模式觀察兩種移植瘤模型小鼠的腫瘤血管情況,并與探頭活體激光共聚焦結(jié)果和病理結(jié)果比較,目的是探討超聲造影觀察腫瘤血管生成情況的可靠性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)動物為雄性 BALB/c裸鼠12只,3～4周齡,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證:SCXK(京)2016-0006,在 SPF級IVC屏障環(huán)境下飼養(yǎng);高頻小動物超聲成像系統(tǒng)(SSharp prospect,臺灣);探頭式光纖活體激光共聚焦(Cellvizio Dual Band,法國);BT-B膀胱癌細(xì)胞和Huh7肝癌細(xì)胞為北京市肝病研究所保存;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司,磷酸鹽緩沖液(PBS)購自賽默飛世爾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;超聲造影劑SonoVue(意大利,Brocca公司);戊巴比妥鈉粉劑(德國進(jìn)口分裝);CD31單克隆抗體購自Abcam公司;伊文氏藍(lán)購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):BT-B膀胱癌細(xì)胞及Huh7肝癌細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含青霉素100 U/mL、鏈霉素 100μg/mL)中生長。在 37℃、5%CO2、完全飽和濕度下培養(yǎng),用 0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化傳代。

1.2.2 建立裸鼠皮下細(xì)胞注射移植瘤模型:調(diào)整BT-B膀胱癌細(xì)胞及Huh7肝癌細(xì)胞濃度均為8×106個/mL,均取0.2 mL皮下接種于裸鼠右側(cè)腋窩處,接種前充分搖勻細(xì)胞懸液,每組6只。定期觀察裸鼠狀態(tài),采用游標(biāo)卡尺觀測瘤體生長情況,記錄瘤體的最大長徑和寬徑,根據(jù)公式:長×寬2/2計算腫瘤體積。

1.2.3 小動物超聲觀測:裸鼠稱其體質(zhì)量,1%戊巴比妥鈉以80 mg/kg的劑量麻醉裸鼠并固定于造影操作臺上,應(yīng)用S-Sharp prospect小動物超聲成像系統(tǒng)的40 MHz高頻率探頭對兩組裸鼠瘤體進(jìn)行超聲掃描,分別于二維灰階B超模式下觀測腫瘤大小、回聲、邊界等表現(xiàn),彩色多普勒模式觀察腫瘤彩色血流情況,頻譜多普勒模式下觀察瘤體血流頻譜情況,選取血流信號最豐富且清晰的切面留圖。然后將造影劑SonoVue與5 mL生理鹽水振蕩混合后,取0.2 mL經(jīng)裸鼠尾靜脈迅速團(tuán)注進(jìn)行超聲造影對比模式觀察,并留取動態(tài)圖像進(jìn)行存儲。選擇感興趣區(qū)域(ROI),并繪制ROI曲線圖,并對造影結(jié)果進(jìn)行后處理分析得到時間強(qiáng)度曲線(time-intensity curve,TIC),峰值強(qiáng)度(peak intensity,PI)、曲線下面積(area under curve,AUC)、達(dá)峰時間(time to peak,TTP)等造影指標(biāo)。

1.2.4 探頭式光纖活體激光共聚焦觀測:消毒后打開裸鼠皮膚,用鑷子鈍性分離并暴露部分腫瘤組織,尾靜脈注射1.5%伊文氏藍(lán)0.2 mL,小心撥開腫瘤表面皮膚,用探頭式光纖活體激光共聚焦的探頭對腫瘤血管進(jìn)行觀測。

1.2.5 病理結(jié)果:頸椎脫臼法處死小鼠,完整剝離腫瘤后用4%多聚甲醛液迅速固定,常規(guī)HE染色及CD31免疫組織化學(xué)染色,進(jìn)行腫瘤微血管密度(microvessel density,MVD)計數(shù),并與超聲造影結(jié)果的指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,各計量結(jié)果均以(±s)表示。超聲造影定量參數(shù)與MVD計數(shù)的相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物成瘤情況

所有裸鼠均成瘤,成瘤率100%。各裸鼠狀態(tài)良好,實(shí)驗(yàn)前期體質(zhì)量均有所增長,實(shí)驗(yàn)后期BT-B膀胱癌組(4只)與Huh7肝癌組(6只)出現(xiàn)了體質(zhì)量下降(圖1A、圖1D)。BT-B膀胱癌組與 Huh7肝癌組瘤體體積均有顯著的增長(圖1B、圖1E)。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(最大腫瘤直徑1.5 cm),BT-B膀胱癌腫瘤體積中位數(shù)為561.65 mm3(最大值 1 056.33 mm3,最小值276.08 mm3)。Huh7肝癌組瘤體體積中位數(shù)1 273.18 mm3(最大值2 489.98 mm3,最小值612.33 mm3)(圖 1C、圖 1F)。

圖1 荷瘤小鼠體質(zhì)量和腫瘤生長生長情況注:A:BT-B膀胱癌組體質(zhì)量隨時間變化圖;B:BT-B膀胱癌組瘤體體積隨時間變化圖;C:BT-B膀胱癌組平均瘤體體積隨時間變化圖;D:Huh7肝癌組體質(zhì)量隨時間變化圖;E:Huh7肝癌組瘤體體積隨時間變化圖;F:Huh7肝癌組平均瘤體體積隨時間變化圖Fig.1 Body weigh t and tum or grow th of tum or bearing m iceNote:A:body weight of BT-B bladder cancer with time;B:volume of tumor of BT-B bladder cancer with time;C:average volume of tumor of BT-B bladder cancer with time;D:weight of Huh7 liver cancer with time;E:volume of tumor of Huh7 liver cancer with time;F:average volume of tumor of Huh7 liver cancer with time

2.2 超聲觀測結(jié)果

2.2.1 二維灰階B超模式觀測結(jié)果:兩組皮下移植瘤均表現(xiàn)為圓形或類圓形的不均質(zhì)回聲結(jié)節(jié),內(nèi)部回聲不均勻,可見散在點(diǎn)狀和片狀高回聲區(qū)及低回聲區(qū);BT-B膀胱癌組整體內(nèi)部回聲較Huh7肝癌組回聲更低(圖 2A、圖 2B、圖 2E、圖 2F)。

2.2.2 彩色多普勒PW模式觀測結(jié)果:兩組皮下移植瘤體內(nèi)部及周邊均可探及血流信號,BT-B膀胱癌組為較多、較粗大條狀血流信號,Huh7肝癌組點(diǎn)狀和小條狀血流信號(圖2G、圖2H)。BT-B膀胱癌組可探及低速高阻血流頻譜,而Huh7肝癌組則幾乎探及不到血流頻譜(圖2C、圖2G)。

圖2 不同模式下腫瘤聲像圖注:A、B:BT-B組二維灰階B超模式圖;C:BT-B組PW模式圖;D:BT-B組彩色多普勒模式血流圖;E、F:Huh7組二維灰階B超模式圖;G:Huh7組PW模式圖;H:Huh7組彩色多普勒模式血流圖Fig.2 Two dim ensional gray-scale B-ultrasound pattern of tum orNote:A,B:BT-B group;C:PW pattern of BT-B group;D:Color Doppler flow pattern of BT-B Group;E,F:two dimensional gray-scale B-ultrasound pattern of Huh7 group;G:PW pattern of Huh7 group;H:Color Doppler flow pattern of Huh7 group

2.2.3 超聲造影CT模式觀測結(jié)果:成功造影10只小鼠,失敗2只,其中 BT-B膀胱癌組5只,Huh7肝癌組5只。超聲造影顯示兩組皮下移植瘤較前均有增強(qiáng),Huh7肝癌組較BT-B組顯示出了更多的微小血管(圖3)。根據(jù)腫瘤的不同增強(qiáng)表現(xiàn),Huh7肝癌組為彌漫性不均勻增強(qiáng),BT-B組為從周邊環(huán)狀或半環(huán)狀增強(qiáng)并向病灶中心增強(qiáng)。兩組皮下瘤超聲造影參數(shù)結(jié)果,見表1。

圖3 超聲造影觀察腫瘤血管內(nèi)部情況Fig.3 Ultrasound contrast mode to observe the internal condition of tum or b lood vessels

表1 Huh7肝癌組與BT-B膀胱癌組超聲造影定量參數(shù)Table 1 Quantitative parameters of contrast-enhanced ultrasound in Huh7 hepatom a group and BT-B b ladder cancer group

2.3 探頭式活體激光共聚焦觀測結(jié)果

分別選擇Huh7和BT-B組各兩只裸鼠尾靜脈注射伊文氏藍(lán)進(jìn)行血管標(biāo)記,然后用小動物探頭激光共聚焦觀察,結(jié)果顯示Huh7肝癌組小血管數(shù)量分布紊亂,直徑較均勻,BT-B膀胱癌組血管分布呈“分支狀”(圖4),與超聲微泡造影觀察的血管特征一致。

2.4 病理結(jié)果

圖4 探頭式活體激光共聚焦觀測結(jié)果Fig.4 In vivo laser con focal observation results

大體標(biāo)本觀察,Huh7肝癌組腫瘤質(zhì)軟、色暗紅,與周圍組織粘連較重;BT-B膀胱癌組腫瘤質(zhì)地較韌、色偏白,與周圍組織較容易分離。切開腫瘤組織,Huh7肝癌組較容易切開,瘤體松軟,出血較多;而 BT-B組腫瘤較難切開,瘤體較硬,出血較少(圖5A～圖5D)。鏡下觀察,Huh7組與BT-B組腫瘤細(xì)胞增生明顯,細(xì)胞分裂像多,核大、核深染(圖5E、圖5F),免疫組化結(jié)果顯示Huh7組血管較BT-B組分布雜亂(圖5G、圖5H),BT-B膀胱癌組腫瘤MVD(19.56±1.47),Huh7肝癌組腫瘤MVD(30.67±6.80)。

2.5 超聲造影參數(shù)與M VD相關(guān)關(guān)系分析

分析超聲造影各項(xiàng)參數(shù)與MVD關(guān)系,結(jié)果顯示峰值強(qiáng)度 PI與 MVD相關(guān)性好(r=0.844,P=0.034),呈正相關(guān),P＜0.05(圖 6)。

圖5 病理結(jié)果注:A、B、C、D:兩組瘤體的大體標(biāo)本 E、F:兩組 HE染色結(jié)果(×400)G,H:CD31染色結(jié)果(×200)Fig.5 Pathological resultsNote:A,B,C,D:gross specimens of two groups of tumors E,F:HE staining results of two groups(×400)G,H:CD31 staining results of two groups(×200)

圖6 超聲造影各參數(shù)與M VD關(guān)系圖Fig.6 Relationship between parameters of contrast-enhanced ultrasound and M VD

3 討論

腫瘤的血管生成一直是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程,且與預(yù)后密切相關(guān)[4-5],所以對腫瘤血管生成的評價至關(guān)重要。腫瘤血管生成情況通常用微血管密度(MVD)來表示,是在高度血管化的腫瘤區(qū)域使用CD31的免疫組織化學(xué)測定用來評估,這也是目前公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而,這是一種有創(chuàng)性檢查方法,并且由于受操作者操作水平、取材的部位、患者本人配合等因素的影響容易出現(xiàn)測量誤差[6]。所以,如何無創(chuàng)且對腫瘤進(jìn)行準(zhǔn)確而全面的評估顯得至關(guān)重要。

本研究通過建立兩種細(xì)胞移植瘤模型,觀察兩種腫瘤在不同超聲模式下的影像特征。發(fā)現(xiàn)在彩色多普勒模式下BT-B組腫瘤血流信號雖然較Huh7組腫瘤多,然而在進(jìn)行超聲造影后,Huh7組顯示了更多的微小血管,BT-B組在原有基礎(chǔ)上顯示出的微血管相對較少。其原因可能是:(1)Huh7組以微小血管為主;(2)雖二者均為腫瘤組織,新生血管較正常組織多,但腫瘤血管的空間分布不同,Huh7組腫瘤微血管的空間分布更加纖細(xì)、紊亂;而BT-B組則為較大血管逐級向下一級分支,呈“分支狀”排列;(3)可能與所選取的腫瘤切面有關(guān),沒有切到最能代表腫瘤血管生成情況的切面。此外,研究樣本數(shù)量較少,受裸鼠個體差異所導(dǎo)致的結(jié)果偏差可能較大。另外,在造影觀察期間,因麻醉及裸鼠呼吸抖動等影響,會造成圖像抖動,對結(jié)果也有一定影響。

我們通過對兩種皮下移植瘤的觀察發(fā)現(xiàn):超聲造影對腫瘤血管分布的顯示與病理和活體激光共聚焦結(jié)果契合性好。Xing等[7]研究表明超聲造影結(jié)果與病理結(jié)果一致性較好,且 PI是目前與病理MVD相關(guān)性最好的一個超聲造影參數(shù),這已經(jīng)被眾多學(xué)者的研究結(jié)果證實(shí)[8-10]。我們的結(jié)果也顯示PI與MVD的相關(guān)性良好,呈正相關(guān),可以作為提示腫瘤血管增殖情況的重要指標(biāo)。所以,超聲造影模式可以作為無創(chuàng)評價腫瘤血管生成的可靠方法。