超聲波改性淀粉及其耦合酶解反應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)

王寶石，譚鳳玲，李光耀，陳艷艷，馬世航，張明霞，孟麗，邱立友

1(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 新鄉(xiāng)，453003)2(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科技學(xué)院，河南 鄭州，450002)

淀粉是儲(chǔ)存在植物中最豐富的天然碳水化合物之一，具有來(lái)源廣泛、可再生、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[1]，是微生物生長(zhǎng)的重要碳源。但傳統(tǒng)高溫液化模式存在能耗高且易產(chǎn)生抑制物等缺陷，長(zhǎng)期制約著生物煉制行業(yè)的技術(shù)提升[2]。近年來(lái)，超聲波在食品物理和工業(yè)生物技術(shù)加工方面取得廣泛應(yīng)用[3]。超聲波具有綠色節(jié)能、傳質(zhì)高效的特征，促進(jìn)了淀粉改性及其輔助酶解的創(chuàng)新發(fā)展，有效規(guī)避了淀粉傳統(tǒng)高溫液化方式的缺陷。

1 超聲波技術(shù)在淀粉改性中的應(yīng)用

為適應(yīng)生物煉制中淀粉轉(zhuǎn)糖的高效、節(jié)能加工需求，國(guó)內(nèi)外研究者針對(duì)淀粉改性手段進(jìn)行了富有意義的探索，一直致力于改善生物煉制過(guò)程中淀粉糖的轉(zhuǎn)化過(guò)程，指出生物煉制中降低能量消耗，關(guān)鍵是改善淀粉至葡萄糖過(guò)程中分子解聚工藝。如在燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)中，此過(guò)程能量消耗占整個(gè)工藝的10%～20%。近年來(lái)，超聲波對(duì)食品工業(yè)中的活性物質(zhì)提取與大分子解聚過(guò)程都有積極的影響，超聲波技術(shù)具有工藝簡(jiǎn)單、效率高、排放低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為淀粉改性領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)(表1)。LI等[4]利用超聲(40 kHz，40 ℃，480 W，30 min)改性玉米淀粉，導(dǎo)致相對(duì)結(jié)晶度降低，偏光十字減小甚至消失，顯著縮短淀粉液化時(shí)間，淀粉晶體類型呈現(xiàn)A-型晶型；CHEN等[5]發(fā)現(xiàn)，超聲波不能改變淀粉的晶體類型，但能使反應(yīng)體系分散，表面積增大，提高后續(xù)酶解反應(yīng)效率。超聲波處理降低了馬鈴薯、小米和糯玉米淀粉的峰值黏度。較低的黏度可能歸因于物理?yè)p傷的淀粉顆粒，增加了水化的透水性。此外，超聲處理過(guò)程中的機(jī)械振蕩和空化會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)鏈斷裂，降低淀粉顆粒間的相互作用力，從而導(dǎo)致黏度降低[6]。然而，超聲處理的大米淀粉的峰值黏度卻呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，顯示出比天然樣品更高的值。超聲波處理對(duì)黏度特性的影響可能取決于淀粉的類型。

超聲波處理甘薯淀粉增加了淀粉顆粒崩解的敏感性，并造成高剪切力和溫度抵抗力的減弱[7]。JIN等[8]超聲預(yù)處理(20 kHz，30 ℃，15 min)甘薯淀粉，采用同步液化及糖化方式，淀粉酶解轉(zhuǎn)化率提高了56.4%。PARK等[9]研究了室溫(25 ℃，30 min)和較高溫度(50 ℃，60 min)條件下超聲處理糙米，發(fā)現(xiàn)較長(zhǎng)的浸泡時(shí)間均可使超聲處理淀粉的晶體結(jié)構(gòu)變得更加均勻，淀粉的熔融焓和相對(duì)結(jié)晶度均顯著降低，但仍保持A-型晶型。低功率超聲波處理淀粉的回生率有所下降，這主要是由于浸出的直鏈淀粉和長(zhǎng)鏈支鏈淀粉的降解和解聚所引起的，對(duì)小麥粉、豌豆和豌豆淀粉的研究也得出了類似的結(jié)論[10]。此外，超聲波改性淀粉會(huì)影響淀粉溶解度，而超聲波處理使淀粉的溶解度增加了1倍以上，其機(jī)理可以描述為超聲波通過(guò)疏松淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)使其降解，使水更容易進(jìn)入網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。淀粉的溶解度跟分子質(zhì)量有關(guān)系，超聲波處理能有效降低淀粉的分子質(zhì)量，從而改善淀粉在水中的溶解度[11]。綜上所述，由于超聲空化引起的自由基和機(jī)械效應(yīng)，超聲波可以解聚淀粉聚合物分子。超聲空化是液體中的微氣核空化泡暴露在超聲場(chǎng)中的一系列動(dòng)態(tài)過(guò)程?？栈窃趬毫档蜁r(shí)形成充滿氣體或水蒸氣的空腔，當(dāng)壓力再次升高時(shí)空化就會(huì)坍塌，會(huì)出現(xiàn)熱點(diǎn)，形成高溫壓力區(qū)，并伴有強(qiáng)烈的沖擊波和微射流。同時(shí)，在超聲波空化效應(yīng)產(chǎn)生的高溫、高壓作用下，水分子在熱點(diǎn)達(dá)到臨界狀態(tài)并發(fā)生裂解，在沖擊波和微射流的作用下，使羥基自由基擴(kuò)散并進(jìn)入整個(gè)超聲體系中，從而發(fā)生機(jī)械效應(yīng)和自由基效應(yīng)。相應(yīng)地，超聲波處理使淀粉分子質(zhì)量進(jìn)一步降低。超聲輻照改變了淀粉的熱性能，溶解度和糊化性能，更有利于糖化酶進(jìn)一步水解淀粉。

表1 超聲波處理對(duì)不同類型淀粉改性的研究Table 1 Modification of ultrasonic treatment on different starch

2 超聲波預(yù)處理對(duì)淀粉多尺度結(jié)構(gòu)的影響

淀粉形態(tài)和晶體結(jié)構(gòu)的改變會(huì)導(dǎo)致溶脹、糊化、流變和其他物理化學(xué)屬性的改變[16]。超聲波預(yù)處理對(duì)淀粉顆粒形貌及結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響，改變淀粉理化特性，有利于淀粉后續(xù)水解過(guò)程。普遍認(rèn)為，經(jīng)過(guò)超聲波處理后，不同來(lái)源的淀粉顆粒表面會(huì)出現(xiàn)明顯的裂縫和氣孔[17]。但超聲波處理對(duì)不同淀粉顆粒大小影響不同，馬鈴薯和糯玉米淀粉的顆粒尺寸減??；而對(duì)燕麥，玉米和糯米淀粉的顆粒尺寸的影響很小[18]。淀粉顆粒破壞程度受到以下因素影響包括淀粉懸浮液的濃度、體系溫度和介質(zhì)類型、淀粉組成和類型以及超聲波處理的功率、頻率和時(shí)間[14]。YANG等[12]也發(fā)現(xiàn)超聲波預(yù)處理(150、300、450、600 W，25 ℃，20 min)對(duì)大米淀粉顆粒的非晶態(tài)區(qū)有輕微破壞，但對(duì)支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布影響不大。淀粉顆粒的無(wú)定形區(qū)域比結(jié)晶區(qū)域更容易被超聲波破壞，超聲波處理對(duì)晶體圖案類型幾乎沒(méi)有影響，淀粉樣品均呈現(xiàn)典型的A型晶型[13]。FALSAFI等[19]使用超聲浴的輻照處理降低了燕麥淀粉的結(jié)晶度，而未觀察到對(duì)XRD峰位的顯著影響；朱杰等[20]運(yùn)用小角X射線散射研究超聲處理淀粉內(nèi)部半結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒內(nèi)層狀結(jié)構(gòu)中電子密度差異減小，而直鏈無(wú)定形背景區(qū)和支鏈無(wú)定形層的電子密度差異變大，且此現(xiàn)象隨著超聲強(qiáng)度增加而更加明顯。超聲波處理破壞了小麥淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致小麥淀粉聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的無(wú)序化程度加深，且無(wú)序化程度隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)而趨勢(shì)愈加明顯[3]。此外，分子質(zhì)量是研究淀粉分子結(jié)構(gòu)的重要基礎(chǔ)參數(shù)之一，直接影響淀粉的物化性質(zhì)。超聲波可以降解來(lái)自不同植物學(xué)來(lái)源的淀粉鏈，能夠顯著影響淀粉分子結(jié)構(gòu)和流變性能[21]。超聲波處理可降低淀粉的分子質(zhì)量，引起結(jié)構(gòu)紊亂和微觀結(jié)構(gòu)變化，扭曲淀粉顆粒的結(jié)晶區(qū)域，并降低糊化焓[22]。超聲誘導(dǎo)淀粉鏈斷裂導(dǎo)致分子質(zhì)量降低，降解過(guò)程歸因于產(chǎn)生局部高壓、高溫和剪切力的空化作用，從而導(dǎo)致淀粉鏈斷裂。由此產(chǎn)生的淀粉糊精具有更小的分子尺寸和更窄的分子質(zhì)量分布[16]。超聲波降解淀粉的分子質(zhì)量有一定限度，當(dāng)?shù)矸蹣悠返姆肿淤|(zhì)量接近極限值時(shí)，超聲效應(yīng)減弱。與電離輻射引起的分子質(zhì)量變化相比，超聲對(duì)淀粉分子質(zhì)量降低的貢獻(xiàn)更大。由于作用在聚合物分子上的機(jī)械應(yīng)力，超聲波會(huì)導(dǎo)致鏈斷裂，優(yōu)先地在鏈的中點(diǎn)附近斷裂聚合物鏈[23]。而糖化酶通過(guò)從鏈末端逐步分裂葡萄糖單位來(lái)攻擊淀粉分子。在酶反應(yīng)的初始階段，分子質(zhì)量變化不大。超聲波降解淀粉，能造成淀粉粒表面出現(xiàn)坑洞，分子質(zhì)量分布趨于減小，黏度等性質(zhì)發(fā)生變化[24]，超聲波輔助酶解反應(yīng)對(duì)淀粉性質(zhì)有較大的影響，超聲波處理使淀粉分子質(zhì)量進(jìn)一步降低，增強(qiáng)了糖化酶對(duì)淀粉的降解作用。

糖化酶在淀粉水解中的作用模式受到淀粉性質(zhì)的影響如溶解度、分子質(zhì)量、大小、支化度、取代基和側(cè)鏈分布[25]。在一定強(qiáng)度范圍內(nèi)，超聲波預(yù)處理淀粉可以加速淀粉的液化和糖化，提高酶解反應(yīng)的速率常數(shù)[4]。超聲波能有效破壞淀粉團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，破壞淀粉鏈，降低淀粉分子質(zhì)量[26]。增加了相互纏繞的聚集體中的游離可移動(dòng)淀粉片段，暴露了更多與酶接觸的部位。淀粉鏈的斷裂歸因于局部高壓、高溫和聲空化產(chǎn)生的剪切力[16]。超聲波在底物上產(chǎn)生的上述結(jié)構(gòu)變化是提高底物對(duì)酶可及性的原因[27]。通過(guò)破壞淀粉結(jié)構(gòu)，超聲波可以降低淀粉分散體的黏度[28]。黏度降低導(dǎo)致超聲強(qiáng)度衰減較弱，傳遞到反應(yīng)體系的能量較多，從而促進(jìn)了反應(yīng)物的混合。因此，超聲波預(yù)處理淀粉為反應(yīng)體系提供了更好的混合條件，并使生成的淀粉片段更容易到達(dá)糖化酶的作用位點(diǎn)，最終加快了酶解反應(yīng)過(guò)程。

3 超聲波耦合酶解反應(yīng)過(guò)程的生物學(xué)效應(yīng)

3.1 溫和超聲波條件對(duì)酶活性的影響

近年來(lái)，超聲波已被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和食品領(lǐng)域，但很少在生物效應(yīng)方面如對(duì)微生物細(xì)胞增殖的加速效應(yīng)、微生物的滅活效應(yīng)以及酶活性的影響等方面進(jìn)行研究[29]。研究人員多致力于超聲波對(duì)酶活性的滅活研究[29]，只有很少的關(guān)于超聲可以改善酶的活性報(bào)道。最近有報(bào)道稱，在較溫和的條件下，超聲并不能使所有的酶失活，也可能會(huì)使其活躍。低頻和強(qiáng)度較弱的超聲波通過(guò)產(chǎn)生瞬態(tài)來(lái)工作空化效應(yīng)，形成自由基和機(jī)械效應(yīng)[30]。形成的聲效應(yīng)直接改變了酶的結(jié)構(gòu)，使其更容易與底物發(fā)生反應(yīng)。因此，協(xié)同超聲波的作用和酶的催化活性使其成為木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的潛在選擇。WANG等[31]探討了超聲波對(duì)纖維素酶活性的影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲(15 W，24 kHz，10 min)處理后，游離纖維素酶活性最高，酶活力比對(duì)照提高18.2%。超聲波處理使纖維素酶表面色氨酸數(shù)量略有增加，纖維素酶蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生一定數(shù)量的變形，隨機(jī)螺旋含量增加[31]；同時(shí)，LADOLE等[32]超聲(24 kHz，6 W和6 min)處理固定在磁性納米粒子上的纖維素酶，固定化纖維素酶的催化活性比對(duì)照提高了近3.6倍，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)纖維素酶構(gòu)象發(fā)生變化是導(dǎo)致超聲后活性增強(qiáng)的原因；YADAV等[33]采用低頻超聲輻射枯草芽孢桿菌ABDR01，改善了其營(yíng)養(yǎng)吸收率以及細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)了果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶的協(xié)同生產(chǎn)；BHALERAO等[34]研究發(fā)現(xiàn),固定化脂肪酶能承受超聲波作用并提高了轉(zhuǎn)化率，指出超聲耦合攪拌是一種潛在強(qiáng)化大豆油化學(xué)酶轉(zhuǎn)化的方法；JADHAV等[35]研究了探針型超聲儀超聲對(duì)脂肪酶活性的影響，經(jīng)超聲處理后(超聲強(qiáng)度12.22 W/cm2，9 min)脂肪酶活性增加2倍，同時(shí)脂肪酶熱力學(xué)參數(shù)(ΔG、ΔS、ΔH和ΔE)顯著降低[35]。綜述所述，超聲波在溫和條件下耦合酶解不會(huì)使酶失活反而能夠改善酶活性，能夠呈現(xiàn)正向的生物學(xué)效應(yīng)。

3.2 超聲波耦合淀粉酶解過(guò)程對(duì)糖化酶活性的影響

超聲波會(huì)改變酶的構(gòu)象，同樣會(huì)引起糖化酶的修飾，導(dǎo)致酶活性發(fā)生有利變化，從而加速反應(yīng)。MENG等[36]探討了超聲波處理對(duì)葡萄糖淀粉酶酶活性的影響，在60 ℃，420 W，10 min超聲波條件下，酶活力較對(duì)照組提高21.1%，超聲波處理后葡萄糖淀粉酶表面色氨酸和酪氨酸的數(shù)量增加，α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲分別增加了17.8%和12.4%。因此，適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜梢约せ钇咸烟堑矸勖富钚?，但活性較高超聲功率對(duì)酶活性有抑制作用。在較高溫度下，酶分子運(yùn)動(dòng)增加，分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而暴露出更多的反應(yīng)位點(diǎn)，超聲溫度為60 ℃時(shí)，糖化酶活力提高22.10%，糖化酶活性易受溫度變化的影響，超聲空化作用與反應(yīng)溫度有關(guān)，也會(huì)阻礙超聲空化作用[37]。超聲波未改變糖化酶最適反應(yīng)溫度，但高溫極端條件下加速了糖化酶的熱滅活，破壞多肽鏈上的分子間相互作用來(lái)影響酶的穩(wěn)定性并使某些酶失活，由于熱滅活和超聲波滅活共同作用的結(jié)果。高溫會(huì)破壞酶分子的中心結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，增加體系的平衡蒸汽壓，更容易形成氣泡，使酶分子的行為發(fā)生改變[38]。在高溫、高超聲功率和長(zhǎng)時(shí)間處理下，超聲導(dǎo)致酶失活，尤其是在超過(guò)65 ℃的高溫條件下。同時(shí)，在65 ℃以下對(duì)混合酶反應(yīng)體系進(jìn)行超聲處理，可顯著促進(jìn)淀粉水解；與超聲預(yù)處理相比，超聲波耦合酶解反應(yīng)過(guò)程處理，通過(guò)超聲波可以部分克服這種阻塞促進(jìn)分子運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)整個(gè)淀粉酶促反應(yīng)體系，使得淀粉水解效率提升5倍以上[39]。此外，生物大分子的流變行為與反應(yīng)溫度相對(duì)應(yīng)，酶的活性隨溫度的變化而變化。適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜梢约せ钐腔傅幕钚裕磻?yīng)速率和酶-底物親和力都有所提高。但高強(qiáng)度的超聲波處理會(huì)抑制酶的活性。在適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚硐?，催化反?yīng)更容易進(jìn)行，所以加速了糖化酶對(duì)淀粉的水解。糖化酶活性的變化可能與酶分子結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)，這些變化可以為超聲耦合酶制劑的開(kāi)發(fā)提供新的思路和研究基礎(chǔ)。此外，傳統(tǒng)酶解系統(tǒng)通常在內(nèi)部傳質(zhì)方面具有局限性，這可能會(huì)延遲反應(yīng)進(jìn)程。

4 展望

超聲波作為一種淀粉改性技術(shù)，具有作用時(shí)間短、降解目的性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單且易控制及能耗較低等優(yōu)點(diǎn)。超聲波處理淀粉不僅可以破壞淀粉顆粒的表面形態(tài)，還可以使內(nèi)部結(jié)構(gòu)變疏松；也可以打斷淀粉顆粒中的鏈條直接降解淀粉，提高酶解的利用性。超聲波空化作用影響淀粉酶的構(gòu)象，在適當(dāng)?shù)臈l件下暴露活性部位，酶構(gòu)象的這些變化促進(jìn)了酶與底物的結(jié)合，從而提高了酶的活性。此外，超聲波由于其有效的混合效果而通常用于增強(qiáng)液-液或液-固過(guò)程。超聲波耦合酶解反應(yīng)方式融合了超聲和酶解間的協(xié)同作用，是未來(lái)淀粉綠色深加工的重要發(fā)展方向，將在工業(yè)應(yīng)用中顯示出巨大的潛力。但超聲波耦合酶解反應(yīng)體系的構(gòu)建及其相關(guān)作用機(jī)理，有待進(jìn)一步深入挖掘。同時(shí)，開(kāi)發(fā)面向工業(yè)化生產(chǎn)的超聲波耦合酶解設(shè)備，為淀粉加工的綠色制造和智能制造奠定基礎(chǔ)。