農藥生產企業(yè)淺層地下水污染物的生物毒性診斷*

余曉燕 余佳龍 馮立峰 童飛鵬

(1.杭州經濟技術開發(fā)區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，浙江 杭州 310018；2.浙江環(huán)茂自控科技有限公司，浙江 杭州 311121；3.杭州市生態(tài)環(huán)境局錢塘新區(qū)分局，浙江 杭州 311225)

當前，場地地下水的污染調查診斷主要是對地下水中部分污染物含量的化學分析，由于場地污染的復雜性，很多情況下化學診斷并不能全面反映場地受污染的情況及各種有毒有害物質對周邊環(huán)境或生物的綜合影響，生物毒性診斷技術可以彌補這一缺陷。周艷等[1]700對某有機污染場地淺層地下水的生物毒性研究發(fā)現，斑馬魚胚胎毒性試驗靈敏度高于成魚急性毒性試驗，可用于污染場地水樣毒性的快速診斷。王超等[2]利用蠶豆根系細胞微核試驗發(fā)現自來水出廠水潛在致突變性較原水強，主要原因為化學消毒劑與水源水中有機物形成了一系列低濃度但具有致突變性的消毒副產物。宋曉威等[3]選擇大型蚤、斜生柵藻、發(fā)光菌為試驗生物，對某廢棄農藥廠污染場地不同區(qū)域淺層地下水進行了化學和生物毒性分析，發(fā)現毒性試驗結果與化學檢測結果有較好的相關性，3種受試生物的毒性效應結果一致。針對污染場地或潛在污染場地，現有的研究認為生物毒性診斷技術是化學診斷的有益補充[4-6]。但必須指出的是，作為一項應用于場地污染識別的實用技術，它應同時具備以下特征：有國際或國家標準支撐，易于操作，耗費較低。經濟合作與發(fā)展組織制定了針對化學品生物毒性效應的標準與工作指南[7]，我國于20世紀90年代參照國際標準也已制定了蚤類(大型蚤)、發(fā)光細菌等水質急性毒性測定方法[8-9]，在2019年頒布了測定水質急性毒性的斑馬魚卵法[10]。

本研究涉及的兩家在產農藥生產企業(yè)廠區(qū)土壤質地為砂質粉土，土壤有機質質量分數僅為0.1%～0.4%，一旦土壤被污染，地下水極易受到影響。本研究以廠區(qū)淺層地下水為研究對象，采用發(fā)光細菌急性毒性試驗和斑馬魚胚胎毒性試驗初步診斷場地淺層地下水的生物毒性，以期為在產企業(yè)的危害識別、風險評估以及污染防治提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究區(qū)域為相鄰的2家農藥生產企業(yè)，企業(yè)A主要生產氟蟲腈和乙蟲腈，企業(yè)B主要生產炔螨特、氟節(jié)胺、丁硫克百威等，均位于杭州。由場地調查取樣專業(yè)公司采用美國Geoprobe Direct Push取樣系統，根據美國材料與測試協會(ASTM)制定的相關技術導則進行操作并建井。企業(yè)A在靠近合成區(qū)域、焚燒爐、罐區(qū)、制劑車間的地方各設一口監(jiān)測井，分別標為A01、A02、A03、A04，企業(yè)B在靠近兩個合成車間生產區(qū)域的地方各設一口監(jiān)測井，分別標為B01、B02(見圖1)。A01建井深度8 m，其余均為6 m。洗井后采樣，用于化學分析以及生物毒性診斷。現場觀察A04地下水有氣泡，B01地下水有刺激性氣味。地下水埋深較淺，采樣期間地下水埋深為0.65～1.14 m，屬第四系潛水類型。

1.2 生物毒性診斷

發(fā)光細菌急性毒性診斷參考文獻[9]進行，發(fā)光細菌凍干粉購自中科院南京土壤研究所，采用30 min的暴露時間。生物毒性分為4級：Ⅰ級(低毒或無毒)，原樣抑制率低于30%為無毒，抑制率30%～50%為低毒；Ⅱ級(中等毒性)，原樣抑制率高于50%，原樣稀釋10倍后，抑制率低于50%；Ⅲ級(高毒)，原樣稀釋10倍后，抑制率高于50%，但稀釋100倍后抑制率低于50%；Ⅳ級(強毒性)，原樣稀釋100倍后抑制率仍高于50%。

斑馬魚胚胎毒性試驗參照文獻[7]進行。挑選發(fā)育正常的受精卵在2.5～3.0 h(囊胚期初期)進行暴露試驗。在細胞培養(yǎng)板中開展試驗，每孔加入2 mL水樣和1枚隨機選取的正常受精卵，(26±1) ℃下，每天按照14 h光照加10 h非光照的周期培養(yǎng)，每隔24 h更換一半水樣，每個處理15孔，試驗設3個重復。采用4種指標表征胚胎毒性：(1)胚胎孵化率，選擇24、48、72 h孵化率指標；(2)胚胎死亡率，選擇24、48、72 h死亡率指標；(3)幼魚存活率，胚胎染毒96 h后統計存活數在孵化數中的比例，表征幼魚期急性毒性；(4)幼魚致畸率，胚胎染毒96 h后統計致畸數(不包括死亡幼魚)在孵化數中的比例，致畸指標包括心包囊腫、卵黃囊腫、脊柱彎曲，由于本次試驗心包囊腫出現頻率高，以該指標作為致畸評價指標。

圖1 采樣點示意圖Fig.1 The distribution of sampling sites

1.3 化學分析

地下水揮發(fā)性有機物測定參考文獻[11]進行，半揮發(fā)性物質、耗氧量、氟化物、重金屬等指標測定參考文獻[12]進行。特征污染物氟蟲腈、乙蟲腈、氟節(jié)胺、克百威、炔螨特、丁硫克百威采用C18富集，液相色譜—三重四級桿質譜法進行分析。由于A04和B01水樣被診斷為具備生物毒性，但化學分析未能明確污染物質，于是將A04和B01水樣進行進一步定性檢測，A04水樣真空濃縮10倍，采用高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜(HPLC-Q-TOF-MS)進行分析，B01水樣用氫氧化鈉調節(jié)pH至10，乙酸乙酯萃取兩次，氣相色譜—質譜分析。

表1 地下水化學分析結果

2 結 果

2.1 地下水化學分析

杭州地區(qū)對地下水沒有明確分類，但在風險評估中一般要求執(zhí)行《地下水質量標準》(GB/T 14848—2017)Ⅲ類標準，即地下水化學組分含量中等，適用于集中式生活飲用水水源及工農業(yè)用水。表1為地下水分析結果。6口井地下水pH均呈中性，pH為7.06～7.34。企業(yè)A不同點位耗氧量差異極大，范圍為1.79～14.20 mg/L。A04(近制劑車間)和A02(近焚燒爐)的地下水耗氧量超過10 mg/L，超過GB/T 14848—2017 Ⅲ類標準, 超標倍數分別為3.06和3.73，由于A02在焚燒爐影響區(qū)域，估計這口井水質可能受焚燒爐作業(yè)影響；氟化物為0.60～1.83 mg/L，A01(近合成區(qū)域)超標；地下水中檢出揮發(fā)性有機污染物1,2-二氯乙烷和氯苯，兩種污染物均未超標。企業(yè)B生產區(qū)兩口井B01、B02耗氧量分別為2.09、7.36 mg/L，B02耗氧量超標；氟化物分別為2.46、0.89 mg/L，B01氟化物超標；揮發(fā)性有機污染物1,2-二氯乙烷有檢出，但未超標。企業(yè)A的特征污染物氟蟲腈、乙蟲腈，以及企業(yè)B的特征污染物氟節(jié)胺、克百威、炔螨特、丁硫克百威均未檢出。因此從地下水化學分析結果判斷，兩個在產農藥生產企業(yè)淺層地下水質量基本可控，但受工業(yè)生產影響，部分指標超標。

2.2 發(fā)光細菌急性毒性診斷

洗井24 h后采地下水分析，發(fā)現企業(yè)A地下水對發(fā)光細菌無毒；企業(yè)B兩口井差異很大，B01發(fā)光細菌抑制率達48%，低毒；B02發(fā)光細菌抑制率低于4%，無毒(見圖2)。上述現象說明企業(yè)B地下水存在一定量的毒性物質， B01綜合毒性高于B02。鑒于兩個農藥生產企業(yè)均存在氟化物超標現象，本研究同時監(jiān)測了水樣中氟化物分別為1.00、2.00 mg/L時的發(fā)光細菌毒性，結果表明氟化物在2.00 mg/L以內無毒。

2.3 斑馬魚胚胎及幼魚毒性分析

取A04、B01水樣進行斑馬魚胚胎毒性分析，蒸餾水作為對照。在受精后不同時間段(24、48、72 h)觀察斑馬魚的發(fā)育變化，統計各試驗組斑馬魚胚胎的孵化數、死亡數和致畸數。

圖2 地下水發(fā)光細菌急性毒性結果Fig.2 Acute toxicity of luminescent bacteria for groundwater

2.3.1 形態(tài)學觀察

B01的24 h胚胎凝固率異常高，顯然其對胚胎具有急性毒性，A04和對照未見明顯毒害作用，說明A04對胚胎期和卵黃囊期的斑馬魚致死作用不明顯。多數斑馬魚胚胎在A04中48 h已完成孵化，但在B01和對照中暴露72 h才完成孵化。96 h時觀察胚胎孵化后的致畸數和死亡數，發(fā)現A04和B01中脊柱彎曲的幼魚基本死亡，B01心包囊腫出現頻率較高。

2.3.2 胚胎死亡率和孵化率

圖3(a)為斑馬魚胚胎死亡率對比情況，對照、A04、B01處理的斑馬魚胚胎24 h死亡率分別為0、15.56%、82.00%，存在顯著差異，且B01在24 h內胚胎凝固率異常高，說明B01對斑馬魚胚胎發(fā)育的早期階段影響很大，具有較強的急性毒性。相比之下A04對胚胎期和卵黃囊期的斑馬魚致死作用較弱，與區(qū)域對照點的胚胎死亡率差異較小(圖3中未列出，區(qū)域對照點24、48、72 h的胚胎死亡率分別為15.56%、15.56%、17.78%)。

圖3(b)為斑馬魚胚胎孵化率對比情況，對照處理72 h孵化率為100.00%；B01的72 h孵化率僅為6.67%，A04的斑馬魚胚胎48 h就已孵化，48 h孵化率達75.56%，72 h孵化率為73.33%，即A04對斑馬魚胚胎具有十分顯著的孵化促進作用，孵化后的幼魚24 h存在死亡現象。

圖3 地下水對斑馬魚胚胎死亡率和孵化率的影響Fig.3 Effects of groundwater on mortality and hatching rate of zebrafish embryos

2.3.3 幼魚存活率和致畸率

對照、A04、B01處理的斑馬魚胚胎孵化數分別為15、11、1條(3組實驗取平均值)；圖4(a)為斑馬魚幼魚存活率對比情況，對照和B01中存活率為100.00%，A04中存活率僅為30.68%。A04對斑馬魚胚胎有孵化促進作用，但對幼魚具有毒性，而B01對斑馬魚早期胚胎致死率極高，但孵化后幼魚存活率高。

圖4(b)為斑馬魚幼魚致畸率對比情況，對照中斑馬魚幼魚未見致畸現象，A04中孵化的幼魚致畸率為12.87%，B01則高達100.00%。

3 討 論

從現場踏勘和信息反饋來看，企業(yè)A環(huán)境管理和污染控制水平優(yōu)于企業(yè)B，企業(yè)A車間布局合理，合成車間和制劑車間底層均為包裝等輕污染工序，企業(yè)B整體為鋼架結構，反應釜就在底層。從化學分析角度，在產農藥生產企業(yè)地下水污染較輕，

圖4 地下水對斑馬魚幼魚致畸率和存活率的影響Fig.4 Effects of groundwater on teratogenic and survival rate of juvenile zebrafish

毒性物質基本可控，兩家企業(yè)地下水耗氧量和氟化物指標超標，企業(yè)A主要檢出1,2-二氯乙烷、氯苯，企業(yè)B檢出1,2-二氯乙烷。由于在產企業(yè)的部分采樣點無法靠近生產區(qū)域，污染物質濃度較低或未檢出并不能代表企業(yè)未受污染，對于在產企業(yè)來說，最主要的是確定有無泄漏，早發(fā)現，早提出對策，從而實現污染防控，因此從檢測手段來說，應優(yōu)先或同時選擇幾種靈敏度高的表征方法，但目前第三方檢測機構基本依據行業(yè)標準對揮發(fā)性、半揮發(fā)性有機污染物進行檢測，其方法更適用于退役場地高濃度污染物的檢測，對于在產企業(yè)非重點生產區(qū)域低濃度污染物的檢測存在局限性。

生態(tài)毒理學的風險綜合診斷方法是化學診斷方法的有益補充。本研究采用發(fā)光細菌急性毒性試驗和斑馬魚胚胎毒性試驗檢測了兩個在產農藥生產企業(yè)淺層地下水的生物毒性，結果表明兩家企業(yè)地下水均存在一定的生態(tài)風險。企業(yè)B地下水發(fā)光細菌急性毒性呈低毒，但斑馬魚胚胎急性毒性非常強，24 h死亡率達82.00%，孵化出的幼魚致畸率為100.00%。企業(yè)A地下水發(fā)光細菌急性毒性為無毒，明顯促進斑馬魚胚胎的孵化，但孵化后幼魚存活率低，僅為30.68%。上述結果表明斑馬魚胚胎毒性試驗可能較發(fā)光細菌急性毒性試驗更為靈敏，具有可記錄多項毒性指標的特點[1]704,[13]1092，更適用于在產企業(yè)地下水污染診斷，但其試驗周期相對較長，相較之下，發(fā)光細菌急性毒性試驗更適用于批量試驗，兩者聯合使用可以快速識別和篩選場地污染區(qū)域。

兩家農藥生產企業(yè)地理位置相鄰，但生物毒性反應并不一致，說明地下水的生物毒性是農藥生產企業(yè)特征污染物所致，并不是區(qū)域共性地下水污染物引起。本研究檢測時發(fā)現A04水樣中含一種除草劑環(huán)莠隆(C11H22N2O)，但企業(yè)否認有該物質，除草劑復配過程需使用表面活性劑，在采樣過程也發(fā)現A04水樣有氣泡(表面活性劑存在的一種表現)。劉迎等[13]1091研究了6種常見農藥表面活性劑對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應，發(fā)現6種表面活性劑均誘導斑馬魚出現身體側翻、游囊關閉的現象。斑馬魚幼魚需要游到水面，呼吸空氣以后游囊才能張開[14]，GOOLISH等[15]認為游囊的正常膨大對于調控魚體上浮下沉，提高取食效率非常重要。鑒于A04水樣對幼魚期斑馬魚開口攝食影響很大，初步判斷該區(qū)地下水可能受農藥表面活性劑的影響。B01水樣檢測到毒性物質2,4-二叔丁基酚，該物質對斑馬魚24 h的半數致死濃度(LC50)為1.866 mg/L，屬于高毒物質[16]。

4 結 語

調查的兩家在產農藥生產企業(yè)淺層地下水存在生物毒性，企業(yè)A地下水發(fā)光細菌急性毒性為無毒，明顯促進斑馬魚胚胎的孵化，但孵化后幼魚存活率低，進一步的風險排查應主要關注環(huán)莠隆和表面活性劑。企業(yè)B地下水發(fā)光細菌急性毒性為低毒，但斑馬魚胚胎急性毒性非常強，建議關注2,4-二叔丁基酚。斑馬魚胚胎急性毒性和發(fā)光細菌急性毒性試驗聯合使用可以快速識別和篩選場地地下水污染區(qū)域。