微生物滅活方法研究進(jìn)展

薛俊靜，喬晉娟，李恒，孟祥英

(濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東 濰坊)

0 引言

微生物對人類最重要的影響之一是導(dǎo)致傳染病的流行。新型冠狀病毒肺炎[1]、埃博拉出血熱[2]、SARS[3]等急性傳染病導(dǎo)致全球經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療損失巨大。近年來，人類在疾病的預(yù)防和治療方面取得非常大的進(jìn)展，但是由于微生物感染而導(dǎo)致的疾病仍舊發(fā)生不斷，無論是最新出現(xiàn)還是重現(xiàn)的感染，一直缺乏有效的藥物去治療這種類似的微生物所致疾病，尤其是人們對于大量廣譜性抗生素的濫用，使得許多菌株發(fā)生變異，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，人類健康受到新的威脅[4]。微生物不僅能夠致病，而且能夠造成食品以及水質(zhì)污染。全球食源性感染每年近15億，約10億是由微生物感染所致[5]，另外，微生物滅活還作用于水質(zhì)的處理[6]。因此滅活其中的微生物對人類飲食健康、疾病預(yù)防都非常重要。

1 微生物滅活方法

針對近年來人類對于微生物滅活需求的不斷升級(jí)，新興的抗微生物光動(dòng)力療法、低電壓脈沖電場法、UV-PS體系滅活法、連續(xù)式超聲場耦合法、三氯異氰尿酸法、連續(xù)式水熱強(qiáng)化滅菌法相對其他傳統(tǒng)的滅活方法具有很大的優(yōu)勢。本文就以上幾種方法進(jìn)行綜述。

1.1 抗微生物光動(dòng)力療法

抗微生物光動(dòng)力療法(anti-microbial photodynamic therapy，APDT)是一種基于光動(dòng)力療法的原理殺滅病原微生物的新方法[7]。APDT通過破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，損傷微生物的DNA以及抑制酶活性來形成不可逆轉(zhuǎn)的損失使之滅活[8]，該療法的副作用小、抗菌譜的范圍廣并且能夠提高微生物對藥物的敏感性。對于診治多重耐藥菌提供了新的思路和研究方向。APDT中的光敏劑(photosensitizer，PS)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)可滅活結(jié)構(gòu)不同的病原微生物，作用方式不盡相同。其中，APDT可滲入革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁內(nèi)起到滅活作用，PS內(nèi)攜帶的陽離子可與革蘭氏陰性菌所帶陰離子相結(jié)合，將其滅活。真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁通透性介于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌之間，PS同時(shí)具有親水性和親脂性，能夠結(jié)合真菌細(xì)胞壁發(fā)揮作用。APDT在病毒中的主要靶點(diǎn)為表面蛋白，可與其結(jié)合，達(dá)到滅活作用。

研究表明，APDT的作用效果與許多因素均有聯(lián)系。其中PS的理化性質(zhì)表現(xiàn)最為明顯[7]，對其進(jìn)行適當(dāng)修飾后，具有最佳的親水性和親脂性，有利于結(jié)合和攝取，作用效果非常好。帶有適量正電荷的PS能更好地與微生物表面帶負(fù)電荷的成分結(jié)合，從而有效發(fā)揮滅活病原微生物及耐藥菌株的作用，并且PS攜帶粒子對革蘭氏陽性菌的作用應(yīng)滿足其與膜上的磷壁酸數(shù)量相匹配，此時(shí)滅活效果最佳。另外，將適當(dāng)金屬離子、取代基及鹵素等引入PS大環(huán)內(nèi)，通過增強(qiáng)三線態(tài)量子產(chǎn)率可提高其介導(dǎo)的APDT的作用效果。除了通過對現(xiàn)有PS進(jìn)行結(jié)構(gòu)改變以增強(qiáng)APDT的作用效果外，也可通過添加無機(jī)鹽來增強(qiáng)PS介導(dǎo)的APDT作用效果。APDT不僅具有創(chuàng)傷小、靶向性、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，而且不產(chǎn)生耐藥性，有望成為傳統(tǒng)藥物的代替療法，且臨床已將此法應(yīng)用于皮膚科[9]。

1.2 低電壓脈沖電場法

低電壓脈沖電場是一種新興的非熱低溫滅菌法[10]。低電壓脈沖電場作用于微生物的細(xì)胞膜，通過電穿孔使細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞吸水脹破，微生物裂解達(dá)到滅活的目的。此法采用低熱的方法實(shí)現(xiàn)了低耗能、低污染，安全指數(shù)也非常高，并且能有效減少食物中營養(yǎng)成分的破壞，近年受到廣泛關(guān)注。在相對較低的電壓范圍內(nèi)，電壓、電容、電導(dǎo)率等均可作為大腸桿菌致死率的影響因素[11]。隨著電壓的升高，通過影響電場強(qiáng)度的增加，來促進(jìn)微生物的滅活，且效果明顯。然而，隨著電容的增加，大腸桿菌的致死率會(huì)呈現(xiàn)出先增大后減小的狀態(tài)，在400 μF時(shí)滅活效果最佳，電容的改變導(dǎo)致電能量的改變，通過電能量的改變來影響低電壓脈沖電場的殺菌效果。此外，隨著電導(dǎo)率的增加，大腸桿菌致死率逐漸減小，當(dāng)介質(zhì)電導(dǎo)率超過一定的范圍后，低電壓脈沖電場將無法有效殺滅大腸桿菌。目前低電壓脈沖電場的殺菌效果還難以達(dá)到商業(yè)無菌水平，因而如何進(jìn)一步改進(jìn)處理室結(jié)構(gòu)、提高殺菌效果，以及如何實(shí)現(xiàn)高通量處理仍需進(jìn)一步研究。

1.3 UV-PS體系滅活法

UV-PS(紫外聯(lián)合過硫酸鹽)體系滅活法是在紫外線滅活的基礎(chǔ)上，克服其復(fù)活缺陷的一種改良方法。UV-PS體系殺菌首先是使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損，細(xì)胞膜破損后進(jìn)入胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)對其內(nèi)容物及DNA的氧化破壞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。研究表明，紫外線滅活(UV)法對大腸桿菌有一定的影響，但經(jīng)紫外線照射后，大腸桿菌細(xì)胞膜仍保持一定的完整性，為復(fù)蘇提供保障，使其滅活效果差，出現(xiàn)了修復(fù)復(fù)活現(xiàn)象[12]。而UV-PS體系殺菌效率高于單獨(dú)UV殺菌及單獨(dú)過硫酸鹽(PS)殺菌。此法不僅滅活效率高，且光復(fù)活能力明顯下降，具有一定研究價(jià)值。用UV-PS體系滅活水中大腸桿菌[13]，其主要影響因素為PS的初始濃度、初始PH以及Fe2+。在紫外劑量相同的條件下，一定范圍內(nèi)PS的初始濃度越高，其滅活效果越好。相反，F(xiàn)e2+的濃度越高滅活效果越差，F(xiàn)e2+雖然能夠作為活化劑增加SO4-，但是Fe2+對紫外線的吸收作用以及絮體的產(chǎn)生影響較前者更加明顯，因此表現(xiàn)為抑制。另外，對于初始pH的作用效果，在中性條件下，滅菌效果最佳。除UV-PS體系滅活法以外，UV/H2O2滅活法[14]、UV-LED聯(lián)合次氯酸鈉滅活法[15]對微生物滅活也具有較好的作用效果。

1.4 植物精油及其成分抗菌法

植物精油及其成分為廣譜抗菌活性的新型抗菌劑[16]，其滅活作用不是由一個(gè)特定的機(jī)制引起，而是作用于細(xì)胞的多個(gè)靶點(diǎn)，涉及整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的一連串反應(yīng)[17]。首先作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，植物精油對其作用方式有多種，主要為抑制植物細(xì)胞壁合成以及干擾其中的蛋白質(zhì)合成表達(dá)，從而限制細(xì)菌的正常生理活動(dòng)。細(xì)胞膜通常是精油作用最關(guān)鍵的靶點(diǎn)，精油通過影響膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子使膜的硬度和滲透壓增加，最終使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性功能喪失。對細(xì)菌而言，DNA是其生長發(fā)育、遺傳代謝過程中發(fā)揮重要作用的信息載體，它的任何損傷都會(huì)直接影響菌體的活性，植物精油則通過破壞細(xì)菌的DNA結(jié)構(gòu)妨礙DNA修復(fù)[18]或抑制其基因表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞溶解。此外，植物精油還作用于細(xì)菌的代謝組、分裂基因、運(yùn)動(dòng)基因進(jìn)而對病原菌的多種生命活動(dòng)產(chǎn)生影響達(dá)到滅活的目的。

1.5 連續(xù)式超聲場耦合法

連續(xù)式超聲場耦合法是物理滅菌法和化學(xué)消毒技術(shù)的耦合。此法最基本的原理為空化作用滅菌，利用空化效應(yīng)產(chǎn)生的瞬間高溫和高壓來滅活微生物。耦合技術(shù)不僅滅活效果好，而且不產(chǎn)生副作用產(chǎn)物，具有非常好的研究前景。連續(xù)式超聲場耦合化學(xué)殺菌劑對大腸桿菌的滅活作用受到多種因素的影響[19]。隨著劑量的增加，大腸桿菌的抑制作用更強(qiáng)，當(dāng)劑量達(dá)到100mg/L時(shí)表現(xiàn)為重度抑制。而超聲頻率的影響機(jī)制相對復(fù)雜，由于超聲頻率越高空化閾值越大，對于大腸桿菌單獨(dú)存在的水樣，頻率低的超聲殺菌率反而比頻率稍高的超聲殺菌率大，但在富含大腸桿菌的共存水樣中，由于對氯苯酚熱解時(shí)可產(chǎn)生氣體，此種氣體充當(dāng)氣核時(shí)使超聲空化閾值降低，超聲殺菌去污效果整體隨超聲頻率的增加而增大；當(dāng)固定超聲功率密度為15 W/L時(shí)，室溫條件下，混頻殺菌去污效果與單頻超聲殺菌去污效果相比，有明顯的優(yōu)勢。同時(shí)，超聲滅菌率與功率密度相關(guān)，隨著功率密度的增加先增加后減小。此外，溫度的作用效果也非常明顯，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，超聲殺菌去污的效果越明顯。研究證明，連續(xù)式超聲場耦合化學(xué)殺菌去污的連續(xù)性和穩(wěn)定性非常好，但其中的空化作用機(jī)理尚未明確，因此，對其進(jìn)行更深入的研究，有利于連續(xù)式超聲場耦合法在臨床上的廣泛應(yīng)用。

1.6 三氯異氰尿酸法

三氯異氰尿酸(Trichloroisocyanuric acid，以下簡稱TCCA)為高效消毒劑，因其具有消毒效果好、成本低、對環(huán)境無害等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于各類食品和水質(zhì)的消毒。TCCA法的作用機(jī)制是破壞酶系統(tǒng)來抑制其新陳代謝，進(jìn)一步滅活細(xì)菌。其滅活效果受到投放量、pH、溫度、氨氮濃度的影響。當(dāng)投放時(shí)間恒定為15min時(shí)，消毒效果隨投放量的增加而增加，在2mg/L及以上濃度滅活效果最佳；當(dāng)投放濃度大于2.5mg/L時(shí)，30min滅菌率達(dá)99.9%。其次，pH在一定范圍(pH 6～9)內(nèi)時(shí)，pH越小，滅活效果越好。溫度對于滅活效果主要作用于化學(xué)反應(yīng)速度，在10～30℃的范圍內(nèi)，溫度越高，反應(yīng)越快，消毒效果越好。相反，在一定時(shí)間內(nèi)，氨氮濃度越高，消毒效果越差。與傳統(tǒng)的氯制消毒劑相比，TCCA法具有非常好的應(yīng)用前景。此法同時(shí)應(yīng)用于臨床滅活多藥耐藥菌，且濃度為500mg/L時(shí)效果最佳[20]。

1.7 連續(xù)式水熱強(qiáng)化滅菌法

連續(xù)式水熱強(qiáng)化滅菌法是針對COVID-19持續(xù)階段研究的微生物滅活法?？蓪?shí)現(xiàn)水樣內(nèi)微生物的完全滅活[21]，操作簡便，能為臨床應(yīng)用提供有效幫助。該方法采用水熱強(qiáng)化試驗(yàn)裝置完成滅活，滅活過程溫度的控制是滅活微生物的關(guān)鍵，油浴加熱，設(shè)置四組平行對照(120、140、160、180℃)30min，滅活率均為100%，且經(jīng)過24h培養(yǎng)后結(jié)果仍為陰性，這表明連續(xù)式水熱強(qiáng)化滅菌法可使樣本微生物幾乎不再具有復(fù)活和繁殖能力，滅菌效果符合實(shí)際應(yīng)用要求。

2 小結(jié)

綜上所述，近年來對于微生物滅活的研究有非常大的進(jìn)展，微生物滅活方法涉及領(lǐng)域更加廣泛，國內(nèi)對微生物滅活的實(shí)際應(yīng)用方面也逐步完善，但針對某些研究方法的作用機(jī)制尚未明確，微生物滅活方法的改良研究尚有缺陷，因此，為達(dá)到更好的滅活效果，對微生物滅活的實(shí)際應(yīng)用研究，我們需要更進(jìn)一步的了解，以找尋更好的滅活方法。