紅曲色素液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究

袁天慧，陳景智，郭天龍，謝翠萍，高益槐，戴金玉，林 娟

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108； 2. 安發(fā)(福建)生物科技有限公司，福建 寧德 352100； 3. 福建省天然生物活性物質(zhì)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 寧德 352100)

0 引言

紅曲色素是微生物發(fā)酵產(chǎn)生的天然可食用色素，色澤鮮艷，廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，如面制品、 肉制品、 腌制品、 飲料和果凍等的著色[1-2]. 紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素是混合色素，紅曲色素具有相似的性質(zhì)難以分離純化，目前已有50多種紅曲色素被鑒定出來(lái)[3]. 紅曲色素的生產(chǎn)方式主要有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種，其對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品分別為紅曲米和紅曲紅(液態(tài)或粉狀). 傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵是將紅曲霉接種在蒸熟的粳米上進(jìn)行發(fā)酵得到紅曲米，其影響因素有：紅曲霉菌種自身特性、 底物、 發(fā)酵過(guò)程中的溫度、 濕度和通氣量等. 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝具有復(fù)雜、 易染菌、 產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)[4]. 液態(tài)深層發(fā)酵歷史較短，有助于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，提高紅曲發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性. 紅曲色素的液態(tài)深層發(fā)酵影響因素有菌株的種類，培養(yǎng)基成分(碳源、 氮源、 無(wú)機(jī)鹽、 生長(zhǎng)因子等)和發(fā)酵條件(如溶氧、 pH值、 溫度)[5-10].

桔霉素和紅曲色素都是紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的聚酮類化合物，它們都是由乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A經(jīng)過(guò)聚酮合成酶的作用生成丁烯酮，然后通過(guò)不同的途徑、 在不同酶系的調(diào)控下形成的[11-12]. 桔霉素對(duì)人體具有嚴(yán)重腎毒性、 致畸、 致癌等不良作用[13]. 它的存在可能會(huì)污染由紅曲霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的食品中，所以紅曲產(chǎn)品中的桔霉素殘留問(wèn)題引起普遍關(guān)注，安全性也受到了廣泛爭(zhēng)議，使我國(guó)紅曲產(chǎn)品的生產(chǎn)、 銷售和出口受到很大影響[14].

本課題組在前期研究中已選育獲得一株高產(chǎn)紅曲色素且基本不產(chǎn)桔霉素的紫色紅曲霉菌株FDSJA-01，并建立了其搖瓶發(fā)酵條件. 本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)其5 L發(fā)酵罐液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝(包括發(fā)酵過(guò)程溶氧和pH值控制、 攪拌器選型及補(bǔ)料策略等)進(jìn)行優(yōu)化，可望為紅曲色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌種

紫色紅曲霉FDSJA-01，由本課題組選育獲得.

1.1.2培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)；

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：麥芽糊精40，葡萄糖 20，蛋白胨 20，MgSO4·7H2O 1，NaNO31，ZnSO4·7H2O 2，KH2PO41，pH值自然；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：麥芽糊精100.00，硫酸銨26.43，ZnSO4·7H2O 0.18，MnSO4·H2O 0.17，MgSO4·7H2O 1.00，乳酸調(diào)節(jié)pH =5.0.

葡萄糖溶液：葡萄糖400 g·L-1，pH值自然.

1.1.3主要儀器設(shè)備

5 L立式發(fā)酵罐(YGF300/5B，洋格生物工程設(shè)備有限公司)； 培養(yǎng)箱(SHP-250，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)； 恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWF-200，上海智城分析儀器制造有限公司)； 紫外分光光度計(jì)(T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限公司)； 高效液相色譜儀(LC-M20A，株式會(huì)社島津制作所).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)方法

挑取4 ℃冰箱保存的紫色紅曲霉, 劃線接種于PDA平板，30 ℃培養(yǎng)5 d左右. 選取生長(zhǎng)狀況良好的紅曲霉平板，加入適量生理鹽水制備孢子懸液，接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于往復(fù)式搖床120 r·min-1、 30 ℃培養(yǎng)48 h. 將一級(jí)種子液以6%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種到二級(jí)種子液中，裝液量為250 mL/1 000 mL，相同條件培養(yǎng)24 h.

1.2.2發(fā)酵方法

將二級(jí)種子液以10%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種到5 L發(fā)酵罐中，裝液量3 L. 設(shè)計(jì)初始發(fā)酵條件為攪拌轉(zhuǎn)速300 r·min-1，通風(fēng)速率3 L·min-1，初始pH值(5.0±0.5)，發(fā)酵13 d，測(cè)定紅曲色素合成曲線以及發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液pH值、 溶氧、 殘?zhí)恰?菌體濕重的變化曲線.

1.2.3濕菌體質(zhì)量測(cè)定方法

取10 mL發(fā)酵液經(jīng)0.45 μm濾膜真空抽濾后，稱量濕菌體質(zhì)量, 可換算發(fā)酵液中所含菌體質(zhì)量(WCW)，單位g·L-1.

1.2.4紅曲色素色價(jià)的測(cè)定

稱取一定量菌絲體，以料液比1∶20(體積比)加入70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，35 ℃浸提90 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液適當(dāng)稀釋后分別測(cè)定在波長(zhǎng)505 nm(紅色素)、 470 nm(橙色素)、 410 nm(黃色素)處的吸光值.

紅曲色素色價(jià)(U·g-1)=(吸光值×稀釋度×料液比)/濕菌體質(zhì)量

(1)

1.2.5發(fā)酵液殘?zhí)呛繙y(cè)定

配制質(zhì)量濃度為20、 30、 40、 50、 60、 70、 80 μg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液. 取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中, 加入0.5 mL 的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))苯酚溶液，然后迅速加入2.5 mL濃硫酸，充分混勻室溫放置30 min，在490 nm處測(cè)定吸光值. 以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.014 7x+0.023 7，R2=0.997 8.

取發(fā)酵液10 000 r·min-1離心10 min，上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，吸取1 mL樣品, 按上述操作測(cè)定OD490，根據(jù)葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液殘?zhí)呛?

1.2.6桔霉素含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱量1.0 mg的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成桔霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后用甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.05、 0.25、 1、 5、 10 mg·L-1. 以桔霉素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=3 019 976x+136 487，R2=0.998.

取一定量發(fā)酵液(含菌絲體)，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，60 ℃水浴浸提90 min后，12 000 r·min-1離心8 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，測(cè)定并計(jì)算發(fā)酵液中桔霉素質(zhì)量濃度[15].

液相色譜分析條件：C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)； 柱溫30 ℃； 流動(dòng)相為乙腈∶水=35∶ 65(體積比)，用色譜純磷酸調(diào)pH值至2.5； 流速1.0 mL·min-1； 檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)331 nm，發(fā)射波長(zhǎng)500 nm； 進(jìn)樣量20 μL.

桔霉素含量計(jì)算方法

ρ=ρ0×V1/V2

(2)

其中：ρ為樣品中桔霉素質(zhì)量濃度，μg·L-1；ρ0為浸提液中桔霉素質(zhì)量濃度，μg·L-1；V1為浸提液體積，mL；V2為發(fā)酵液體積，mL.

2 結(jié)果與討論

2.1 5 L發(fā)酵罐紅曲色素液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)曲線的測(cè)定

由圖1發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵參數(shù)的變化曲線可知，在0～48 h，紫色紅曲霉FDSJA-01菌體生長(zhǎng)緩慢，處于遲緩期，殘?zhí)呛考叭苎踝兓淮?，pH值快速下降至3左右，在此期間紅曲色素合成較少； 48～96 h，發(fā)酵液中殘?zhí)呛考叭苎蹩焖傧陆?，菌體大量生長(zhǎng)，紅曲霉處于快速生長(zhǎng)期，紅曲色素合成速率加快； 96～168 h，溶氧處于較低水平，殘?zhí)呛肯陆稻徛?，菌體快速生長(zhǎng)，次級(jí)代謝產(chǎn)物紅曲色素合成加快； 發(fā)酵168 h后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，紅曲色素不斷積累，264 h胞內(nèi)紅曲色素產(chǎn)量達(dá)到最高，紅色素617.63 U·g-1，橙色素661.38 U·g-1，黃色素756.21 U·g-1. 發(fā)酵過(guò)程中，0～48 h，pH值迅速下降，48 h后pH值變化緩慢維持在2.5～3.0.

圖1 發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵參數(shù)的變化曲線Fig.1 Variation curves of monascus pigment and process parameters in fermentation

2.2 不同類型攪拌器對(duì)紅曲色素合成的影響

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩種攪拌器——四直葉圓盤渦輪攪拌器和六折葉DT602攪拌器，研究不同類型攪拌器對(duì)紫色紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)及紅曲色素合成的影響，結(jié)果如圖2、 3所示.

圖2 不同類型攪拌器作用下發(fā)酵過(guò)程溶氧、 糖代謝、 pH值和生物量的變化曲線Fig.2 Variation curves of dissolved oxygen, glycometabolism, pH value and biomass in fermentation under different agitators

由圖2、 3可知，使用六折葉DT602攪拌器與四直葉圓盤渦輪攪拌器相比，兩種攪拌器在發(fā)酵過(guò)程中pH值變化趨勢(shì)基本一致； 使用六折葉DT602攪拌器發(fā)酵過(guò)程中菌體耗氧速率快，整體上相對(duì)于四直葉攪拌器提前24 h； 使用六折葉DT602攪拌器，發(fā)酵液中殘?zhí)呛肯陆邓俣缺容^快，120 h后降至20 g·L-1左右； 在菌體量上，使用六折葉攪拌器的生物量比四直葉攪拌器增加了55.3%； 在六折葉DT602 攪拌器作用下，發(fā)酵至216 h，紅曲色素的累積量比四直葉圓盤渦輪攪拌器增加了34%. 綜上所述，使用六折葉DT602 攪拌器菌體生長(zhǎng)情況較好，因此選擇六折葉DT602攪拌器.

2.3 不同過(guò)程pH值對(duì)紅曲色素合成的影響

在微生物生長(zhǎng)及發(fā)酵過(guò)程中，pH值是一個(gè)重要的參數(shù)，影響菌體中各種酶的活性進(jìn)而影響產(chǎn)物的合成. 紫色紅曲霉的最適生長(zhǎng)pH值為4.5，最適發(fā)酵pH值為3.5，本研究分別控制發(fā)酵過(guò)程pH值為(3.5±0.5)和(4.5±0.5)兩種情況，觀察pH值對(duì)FDSJA-01發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)變化及紅曲色素合成的影響，結(jié)果如圖4、 5所示.

圖4 不同過(guò)程pH值控制下發(fā)酵過(guò)程溶氧、 糖代謝和生物量的變化曲線Fig.4 Variation curves of dissolved oxygen, glycometabolism and biomass under different fermentation pH value

圖5 不同過(guò)程pH值控制下發(fā)酵過(guò)程紅曲色素合成曲線Fig.5 Synthesis curves of red monascus pigment under different fermentation pH value

由圖4、 5可知，控制發(fā)酵過(guò)程pH值為 3.5時(shí)，前期菌體生長(zhǎng)在相較于控制pH 值為4.5時(shí)相對(duì)緩慢些，但整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中菌體量穩(wěn)步上升； 72～144 h過(guò)程中，溶氧處于較低水平，此時(shí)菌體大量生長(zhǎng)，代謝旺盛，144 h之后，溶氧開(kāi)始回升，菌體生長(zhǎng)緩慢進(jìn)入次級(jí)代謝產(chǎn)物合成階段，紅曲色素大量合成，菌體量在192 h達(dá)到最高，為135 g·L-1； 紅曲色素216 h達(dá)到最高，紅色素1 242.00 U·g-1，橙色素1 080.00 U·g-1，黃色素969.75 U·g-1，紅曲色素積累量相較于控制pH值為4.5時(shí)提高44%，所以控制發(fā)酵過(guò)程的pH值為3.5.

2.4 溶氧對(duì)紅曲色素合成的影響

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，溶氧與微生物生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)，紫色紅曲霉在 5 L罐發(fā)酵過(guò)程中可通過(guò)改變攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量實(shí)現(xiàn)控制溶氧. 本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵過(guò)程中開(kāi)啟發(fā)酵罐控制器上“攪拌與溶氧關(guān)聯(lián)模式”，分別控制溶氧維持在(20±5)%、 (40±5)%和 (60±5)% 3個(gè)水平，研究發(fā)酵過(guò)程中不同溶氧水平對(duì)紅曲色素合成的影響. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6、 7所示.

圖6 不同溶氧水平下發(fā)酵過(guò)程糖代謝和生物量的變化曲線Fig.6 Variation curves of glycometabolism and biomass in fermentation at different levels of dissolved oxygen

圖7 不同溶氧水平下發(fā)酵過(guò)程紅曲色素合成曲線Fig.7 Synthesis curves of monascus pigments at different levels of dissolved oxygen

由圖6、 7可知，控制溶氧維持在(20±5)%水平時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中糖消耗速率相對(duì)緩慢，前期菌體生長(zhǎng)速度慢，在發(fā)酵后期菌體量較多，紅曲色素合成也逐步增加，但是發(fā)酵過(guò)程較長(zhǎng)不利于生產(chǎn)； 控制溶氧維持在(40±5)%水平時(shí)，糖消耗速率加快，菌體生長(zhǎng)良好，發(fā)酵至216 h時(shí)，菌體量達(dá)到最高并且紅曲色素產(chǎn)量也達(dá)到最高，紅色素1 467.00 U·g-1，橙色素 1 449.00 U·g-1，黃色素1 250.25 U·g-1； 控制溶氧維持在(60±5)%水平時(shí)，糖消耗速率最快，但整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中菌體含量最低，紅曲色素產(chǎn)量不高. 因此，紫色紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中最利于紅曲色素合成的溶氧水平為(40±5)%.

2.5 補(bǔ)料對(duì)紅曲色素合成的影響

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，向發(fā)酵液中補(bǔ)充一定量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以維持菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的合成，防止發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)代謝受阻或者菌體衰亡. 紫色紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中流加補(bǔ)充葡萄糖可以延長(zhǎng)菌體的穩(wěn)定期，增加紅曲色素合成的時(shí)間，提高紅曲色素產(chǎn)量. 發(fā)酵至96 h時(shí)，向發(fā)酵罐中補(bǔ)加400 g·L-1葡萄糖溶液，流加速率為5 mL·h-1，流加到230 h停止，研究補(bǔ)糖對(duì)紅曲色素合成的影響，結(jié)果如圖8所示.

圖8 補(bǔ)糖對(duì)發(fā)酵過(guò)程殘?zhí)恰?生物量和紅曲色素合成的影響Fig.8 Effects of feeding on residual sugar, biomass and monascus pigment synthesis during fermentation

由圖8可知，在紫色紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中流加補(bǔ)糖有助于紅曲色素的積累，發(fā)酵264 h時(shí)紅色素 3 454.90 U·g-1，橙色素3 746.70 U·g-1，黃色素3 295.80 U·g-1，相較于未補(bǔ)糖時(shí)紅曲色素總產(chǎn)量提高1.52倍. 因此，在紅曲霉菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)难a(bǔ)糖，可促進(jìn)紅曲色素的合成.

2.6 FDSJA-01發(fā)酵液桔霉素質(zhì)量濃度測(cè)定

在色素產(chǎn)量達(dá)到最高(264 h)時(shí)，取發(fā)酵液, 對(duì)桔霉素進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示. 通過(guò)計(jì)算HPLC檢測(cè)結(jié)果，得經(jīng)FDSJA-01菌株發(fā)酵264 h, 桔霉素質(zhì)量濃度僅為29.12 μg·L-1，低于國(guó)家液態(tài)樣品限量標(biāo)準(zhǔn)50 μg·L-1[14].

圖9 桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品及FDSJA-01發(fā)酵液中桔霉素的高效液相色譜分析Fig.9 Chromatogram graphs of citrinin standard and citrinin content of FDSJA-01 fenmentation broth detected by HPLC

3 結(jié)語(yǔ)

生產(chǎn)菌種發(fā)酵水平的提升主要借助于發(fā)酵生產(chǎn)工藝控制技術(shù)的改良與提高. 通過(guò)研究紫色紅曲霉FDSJA-01液態(tài)發(fā)酵過(guò)程溶氧、 pH值、 攪拌器類型以及補(bǔ)料條件對(duì)菌絲體生長(zhǎng)、 糖代謝和紅曲色素合成的影響，建立5 L發(fā)酵罐液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件，經(jīng)過(guò)優(yōu)化，紅色素可達(dá)3 454.90 U·g-1，提高了4.6倍，總紅曲色素產(chǎn)量提高了4.2倍，桔霉素質(zhì)量濃度為29.12 μg·L-1，符合我國(guó)對(duì)紅曲液態(tài)產(chǎn)品桔霉素含量的限量標(biāo)準(zhǔn)要求.