致瀉大腸埃希氏菌檢驗用標準菌株的研究

張彩文，李金霞，陳怡文，都海渤，劉佳奇，辛迪，石靚，崔生輝，姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 2(中國食品藥品檢定研究院，北京，100050)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)又稱大腸桿菌，是人類目前研究最多的微生物，在全球不同的科學領(lǐng)域均有廣泛應用[1]。E.coli是人和動物腸道中的正常棲居菌，大部分E.coli在正常情況不僅不會損害人類健康，而且在一定程度上能夠保障人體腸道功能[2]。然而有些E.coli菌株攜帶致病基因，稱之為致瀉大腸埃希氏菌(diarrheogenicE.coli，DEC)，可導致人或動物腹瀉、腹痛甚至出血性腹瀉[2-4]。根據(jù)DEC的毒力因子、致病機理和流行病學特征，通常將其分為5類：產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenicE.coli，ETEC)、腸道集聚性大腸埃希氏菌(enteroaggregativeE.coli，EAEC)、腸道出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)、腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enterotoxigenicE.coli，EIEC)和腸道致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenicE.coli，EPEC)[5]。其中EHEC是由產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(shiga toxin-producingE.coli，STEC)進化而來的，是STEC的主要亞群[6]。DEC是導致全球胃腸道疾病的主要原因之一，是人類公共衛(wèi)生領(lǐng)域需要解決的一個重要問題，而腹瀉病主要是通過“糞便-口腔”途徑傳播[7]，因此食品中DEC的檢測工作至關(guān)重要。

DEC傳統(tǒng)的鑒定檢測方法包括分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析、生化鑒定及血清學鑒定等。DEC血清學鑒定方法是依據(jù)細菌表面的單一抗原表位對目標菌進行分型，但具有局限性，不能完全反映菌株間的遺傳關(guān)系，也不能有效區(qū)分致瀉大腸埃希氏菌和非致瀉大腸埃希氏菌，從而導致鑒定結(jié)果不準確[3]，建議將其作為初步檢測或補充驗證方法[5]。在DEC傳統(tǒng)的檢測方法基礎(chǔ)上，有必要進行E.coli毒力基因的檢測，以提高其檢出率[8]。

標準菌株是由國內(nèi)或國際菌種保藏機構(gòu)保藏，分類學地位明確，具有特定生物學性能、遺傳學穩(wěn)定并且可溯源的特殊標準樣品[9]。標準菌株在食品微生物檢驗工作中發(fā)揮著重要的輔助作用[10]，是保證食品檢測質(zhì)量、確保檢測數(shù)據(jù)準確可靠的標準參照物[11]。國家標準GB 4789.6—2016《食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》[12]對我國食品行業(yè)中DEC的檢驗工作具有重要的指導意義，標準方法要求DEC特征性基因PCR確認試驗需要使用陽性、陰性對照菌株，但未明確陽性對照標準菌株菌號。本文利用細菌多相分類學鑒定方法確認了7株E.coli的分類學地位，并根據(jù)GB 4789.6—2016標準方法檢驗7株菌的DEC相關(guān)毒力基因攜帶情況，評價其作為標準菌株的可行性，以期為我國食品微生物檢驗工作提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

7株供試菌株均來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)，分別是產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌CICC 10667、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌CICC 10670、腸道集聚性大腸埃希氏菌CICC 24186、腸道出血性大腸埃希氏菌CICC 24187、腸道侵襲性大腸埃希氏菌CICC 24188、腸道致病性大腸埃希氏菌CICC 24189和大腸埃希氏菌CICC 10003。

1.1.2 試劑

商品化試劑盒：革蘭氏染色試劑盒，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit、E.Z.N.A.?Cycle Pure Kit，Omega Bio-Tek公司；EPEC-STEC-EHEC多重PCR檢測試劑盒、EAEC多重PCR檢測試劑盒、ETEC多重PCR檢測試劑盒、EIEC多重PCR檢測試劑盒，環(huán)凱微生物科技有限公司。

引物：16S rRNA基因擴增選擇通用引物27F/1492R；參照GB 4789.28—2016標準中5種致瀉大腸埃希氏菌的目標基因uidA、bfpB、escV、invE、sth、stp、lt、stx1、stx2、pic、astA、aggR所對應的引物序列信息，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成相關(guān)引物。

PCR試劑：2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye)，北京全式金生物生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司。

生理生化試劑：營養(yǎng)肉汁瓊脂(nutrient agar,NA)培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(tryptose soya agar,TSA)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；VITEK微生物鑒定系統(tǒng)革蘭氏陰性桿菌(gram negative,GN)鑒定卡，法國生物梅里埃公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nikon ECLIPSE Ni-U光學顯微鏡，日本尼康(Nikon)公司；VITEK?2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)，法國生物梅里埃公司；Eppendorf Centrifuge 5424R高速離心機、Eppendorf Research?plus單道系列移液器，德國Eppendorf公司；Biometra Tprofessional Thermocycler TRIO 48 PCR儀，德國Biometra公司；Thermo EC250-90電泳儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Bio-Rad Gel DOCTM EZ凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 形態(tài)學觀察

將7株供試菌株分別接種于NA或TSA固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察其在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，并利用光學顯微鏡進行菌體特征觀察。

1.3.2 基因組DNA提取

采用商品化試劑盒E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit提取7株細菌基因組，具體方法和步驟參照試劑盒說明書。所提取的菌株DNA采用E.Z.N.A.?Cycle Pure Kit進行純化，利用核酸蛋白分析儀檢測基因組DNA的濃度和純度，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

1.3.3 16S rRNA基因PCR擴增及分析

分別以7株供試菌株的基因組DNA為模板，利用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rRNA基因，PCR反應體系：2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye) 25 μL，DNA模板2 μL，引物各1 μL，補充去離子水至50 μL；PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行驗證后，送于北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。將16S rRNA基因測序結(jié)果分別在EzBiocould數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/)進行相似性比對，并采用ClustalX程序進行同源性序列分析，使用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 生理生化鑒定

采用VITEK?2 GN鑒定卡與VITEK?2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)對7株供試菌株的碳源利用、耐藥性以及酶類活性47種生化指標進行檢測鑒定。

1.3.5 致瀉性大腸埃希氏菌毒力基因檢測

參照GB 4789.6—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》方法，對7株供試菌株進行毒力基因PCR擴增，并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物[13]，同時分別采用商品化EPEC-STEC-EHEC多重PCR檢測試劑盒、EAEC多重PCR檢測試劑盒、ETEC多重PCR檢測試劑盒和EIEC多重PCR檢測試劑盒驗證其毒力基因檢測結(jié)果。將檢測出的毒力基因PCR產(chǎn)物送于北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，并將獲得的毒力基因序列與GB 4789.6—2016中提供的相關(guān)目標基因進行序列對比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學特征

7株供試菌株在NA或TSA培養(yǎng)基上菌落分別呈乳白色或微黃色，圓形，表面光滑，半透明，邊緣整齊；菌體短桿狀，單個或成對排列，不產(chǎn)芽胞，革蘭氏陰性。

2.2 16S rRNA基因序列分析

7株供試菌株采用引物27F和1492R擴增獲得16S rRNA基因序列，利用EzBiocloud數(shù)據(jù)平臺進行同源性比對分析，結(jié)果顯示與其序列相似度>98.65%[13]的菌種均屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，主要包括弗氏埃希氏菌Escherichiafergusonii、弗氏志賀氏菌Shigellaflexneri、宋內(nèi)氏志賀氏菌Shigellasonnei、大腸埃希氏菌E.coli、鮑氏志賀氏菌Shigellaboydii、阿氏埃希氏菌Escherichiaalbertii、痢疾志賀氏菌Shigelladysenteriae、旱獺埃希氏菌Escherichiamarmotae。以模式菌株P(guān)antoeaagglomeransDSM 3493T為外群，采用鄰近法構(gòu)建7株供試菌株與相關(guān)近源模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖1可知，7株供試菌株的16S rDNA序列在埃希氏菌屬(Escherichiasp.)與志賀菌屬(Shigellasp.)之間無法區(qū)分，因此不能通過16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析將其鑒定到種水平。

圖1 7株供試菌株16S rRNA基因序列發(fā)育分析Fig.1 The phylogenetic analysis of tested strains based on 16S rRNA gene注：鄰位連接法顯示7株供試菌株與相關(guān)種的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1000次的相似度重復計算，圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值，上標的“T”表示模式菌株

2.3 生理生化鑒定

VITEK?2微生物鑒定系統(tǒng)中的GN鑒定卡可以自動鑒定大多數(shù)具有臨床意義的發(fā)酵和非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，其中包括大部分腸桿菌科細菌。CROWLEY等[14]采用VITEK?2 GN鑒定卡與VITEK 2全自動微生物鑒定系統(tǒng)對720株革蘭氏陰性菌進行鑒定分析，評估了VITEK?2 GN鑒定卡的性能，其中60株E.coli的鑒定結(jié)果正確率高達100%。E.coli的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析常在Escherichiasp.與Shigellasp.之間無法區(qū)分，可利用VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)將其精確到種水平[15]。使用GN鑒定卡對7株腸桿菌科供試菌株的碳源利用、耐藥性及酶活性生理生化指標進行檢測。運用VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)分析得知，7株供試菌株鑒定結(jié)果均為E.coli，鑒定概率百分比均在95%～99%(表1)，鑒定結(jié)果可靠。

2.4 致瀉性大腸埃希氏菌毒力基因檢測結(jié)果

根據(jù)GB 4789.6—2016標準方法，對7株E.coli進行管家基因uidA以及11種毒力基因PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2，共擴增出21個目的條帶。采用4種商品化多重PCR檢測試劑盒驗證其毒力基因檢測結(jié)果。如表2所示，供試菌株CICC 10667、CICC 10670、CICC 24186、CICC 24187、CICC 24188、CICC 24189檢測出不同的毒力基因組合：菌株CICC 10003只檢出uidA基因，屬于非致瀉E.coli；CICC 10667檢出uidA、sth、lt基因，屬于ETEC；CICC 10670和CICC 24187檢出uidA、escV、stx1、stx2基因，未檢出bfpB基因，屬于STEC/EHEC；CICC 24186檢出uidA、pic、astA、aggR基因，屬于EAEC；CICC 24188檢出uidA、invE基因，屬于EIEC；CICC 24189檢出uidA、bfpB、escV基因，未檢出stx1、stx2基因，屬于EPEC。

圖2 7株供試菌株毒力基因電泳檢測結(jié)果Fig.2 The electrophoretic detection of virulence gene of E.coli strains注：M, DL2000 Marker;1, uidA;2, aggR;3, astA;4, pic;5, bfpB;6, escV;7, stx1;8, stx2;9, lt;10, stp;11, sth;12, invE

表2 7株大腸埃希氏菌毒力基因特征Table 2 The characteristics of virulence gene of E.coli strains

將7株供試菌株的21個檢出基因測序結(jié)果分別與GB 4789.6—2016中提供的相關(guān)目標基因已知序列進行序列比對。如表3所示，7株菌的各個特征性基因與已知序列同源性達96%～100%。

表3 7株大腸埃希氏菌特征性基因序列分析Table 3 The analysis of characteristic gene of of E.coli strains

3 結(jié)論與討論

DEC是造成人體中、重度腹瀉的重要病原菌，開展食品中DEC檢測工作對維護食品安全意義重大。DEC血清分型是一種常規(guī)的病原鑒定和診斷方法，不同的DEC病理類型具備特異的毒力基因庫。研究表明DEC血清型與毒力基因存在一定程度差異[2]，毒力基因相對于血清型具備更好的穩(wěn)定性，因此在食品安全風險監(jiān)測中開展DEC毒力基因檢測有利于辨別其致病類型。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，多重PCR方法在DEC檢測中的應用越來越廣泛[2-3,5]，已經(jīng)有成熟的商品化多重PCR檢測試劑盒在市場上推廣應用，提高了食品中DEC檢驗工作效率。此外，高通量基因組學也逐漸融入到菌株流行病學研究中，全基因組分析方法的應用正成為DEC基因組學研究的常態(tài)，通過對其全基因組序列的解碼將揭示出更多的菌株信息，反映出更清晰的致病機理[16-17]。

本文采用細菌多相鑒定方法對7株E.coli進行分類學鑒定，并根據(jù)GB 4789.6—2016標準方法對其進行DEC相關(guān)毒力基因PCR確認試驗。結(jié)果表明：CICC 10003只攜帶uidA基因，符合標準中陰性對照菌株特征；其余6株E.coli分別攜帶不同組合的毒力基因，符合該標準中相應DEC菌株特征。因此菌株CICC 10667、CICC 24186、CICC 24188、CICC 24189可分別作為GB 4789.6—2016中ETEC、EAEC、EIEC、EPEC的陽性對照菌株，CICC 10670和CICC 24187可作為STEC/EHEC的陽性對照菌株，CICC 10003可作為陰性對照菌株。同時這7株菌有望成為商品化DEC多重PCR檢測試劑盒的質(zhì)控菌株，以期為我國食品中DEC檢驗工作提供有效參考，保證標準實施的一致性和檢測結(jié)果的準確性。