快速工藝與傳統(tǒng)工藝下曲霉型豆豉發(fā)酵過程中細菌演替的比較

李浩，梁琦，楊慧林，文鶴，王筱蘭

(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌，330022)

豆豉作為國內(nèi)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品的代表，可分為曲霉型、毛霉型、細菌型等類型[1]。就曲霉型豆豉而言，其起源最早且分布最廣，具有開胃消食、抗氧化[2]、溶血栓[3]等多重功效，是我國居民飲食生活中的調(diào)味品。雖然曲霉型豆豉的制作工藝不一，但均含制曲、發(fā)酵2個過程。其中，制曲周期較短且工藝差異較小，常由工業(yè)化的曲霉菌種完成；而發(fā)酵周期往往更長且工藝不一，許多發(fā)酵參數(shù)(如拌鹽量、發(fā)酵溫度等)常存在一定差別，造就了曲霉型豆豉營養(yǎng)風味的多樣化[4]。由于微生物存在于制曲與發(fā)酵的全過程，其通過酶解及自身代謝可生成復雜多樣化的產(chǎn)物，而不同工藝下曲霉型豆豉菌群結構差異一定程度上是造成營養(yǎng)風味差異的根本原因，這側面表明了準確揭示豆豉菌群結構的必要性。

鑒于此，過去許多研究者利用諸類工具對豆豉菌群結構展開了探究。就可培養(yǎng)法而言，大量學者利用該技術對豆豉菌群結構進行了探究[5-7]，而可培養(yǎng)法存在許多局限性，但也具有區(qū)分菌株活性并獲得菌種資源的優(yōu)勢。也有學者利用分子生物學技術進行探究，如限制性片段長度多態(tài)性技術[8]、變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)技術[9]，CHEN等[10]結合可培養(yǎng)法和DGGE技術解析了制曲階段的菌群結構。伴隨著測序技術的發(fā)展，以高準確率、高通量著稱的二代測序技術應運而生。李曉然等[11]率先運用454測序平臺闡明了云南細菌型豆豉的菌群結構，而測序成本逐漸降低，包括本課題組在內(nèi)的一些學者[12-14]也對豆豉制曲及發(fā)酵中的菌群結構變化進行了研究。然而，高通量測序技術也存在一些弊端，如無法區(qū)分菌株存活和鑒定至種水平等[15]，而可培養(yǎng)法恰與其形成優(yōu)勢互補。為此，已有一些學者利用可培養(yǎng)法結合高通量技術，對泡菜[16]、普洱茶[17]等發(fā)酵食品的菌群結構展開了探索，但關于豆豉的類似研究仍未見報道。

本研究以快速工藝與傳統(tǒng)工藝下曲霉型豆豉為研究對象，基于兩者發(fā)酵過程中重要理化因子的差異，一方面通過可培養(yǎng)法比較其優(yōu)勢細菌分布的整體差異，另一方面結合高通量測序技術深入剖析兩者細菌群落的演替差異，并就發(fā)酵細菌基因進行了功能預測。本研究更科學地揭示2類豆豉發(fā)酵過程中細菌演替差異，同時，也旨在為后續(xù)曲霉型豆豉的風味改善試驗提供有效理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腦心浸液肉湯(brain heart infusion，BHI)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，海博生物公司；乳酸細菌(MRS)培養(yǎng)基，索萊寶生物公司；氯霉素、納他霉素，阿拉丁生化公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，OMEGA公司；DreamTaq Green PCR Mix，Thermo Fisher公司；常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TM902C數(shù)顯溫度計，安晟一電子科技公司；PB-10型pH計，Sartorius公司；DH4000II電熱恒溫培養(yǎng)箱，泰斯特儀器公司；ZQZY-GS8V電熱恒溫搖床，知楚儀器公司；HICO 21高速離心機，生工生物工程公司；T100 PCR儀、GelDoc XR凝膠成像儀，Biorad公司；DYY-6C凝膠電泳儀，六一儀器廠；Nanodrop-2000超微量分光光度計，Thermo Fisher公司；HiSeq 2500測序儀，Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆豉樣品的采集

曲霉型豆豉樣品，稻香園調(diào)味食品公司。樣品含快速工藝和傳統(tǒng)工藝2種，兩者均先經(jīng)7 d制曲階段(米曲霉滬釀3.042，接種質(zhì)量分數(shù)為0.001 5%)，并經(jīng)洗曲、堆積后，再運用不同工藝進行控溫發(fā)酵(發(fā)酵罐7 d和發(fā)酵池約3周)。采樣為同一發(fā)酵容器的3個區(qū)域分層(上、中、下)采樣，同一區(qū)域的各層樣品經(jīng)充分混合后，裝入同一無菌自封袋，即每個發(fā)酵階段含3個樣品。采樣方式為初、中、末3個時期的跟蹤采樣，快速工藝在發(fā)酵第1、4、7天采樣(編號：R1、R4、R7)，傳統(tǒng)工藝在發(fā)酵第1、7、21天采樣(編號：T1，T7，T21)，樣品采集完畢即保存于冰盒，并盡快運回實驗室備用。

1.3.2 重要理化因子的測定

豆豉采樣時，使用數(shù)顯金屬溫度計測定發(fā)酵溫度。將2 g豆豉置于研缽充分碾碎，溶于50 mL純水中，利用pH計進行pH測定。豆豉NaCl含量的測定采用銀量法，具體參考GB 5009.44—2016《食品安全國家標準 食品中氯化物的測定》[18]。

1.3.3 豆豉微生物的分離培養(yǎng)與鑒定

豆豉微生物采用梯度稀釋法(10-3～10-7梯度)涂布培養(yǎng)。細菌通過BHI培養(yǎng)基(另加0.1 g/L納他霉素)于37 ℃培養(yǎng)24 h；真菌通過PDA培養(yǎng)基(另加0.025 g/L氯霉素)于28 ℃培養(yǎng)72 h；乳酸菌通過厭氧雙層MRS培養(yǎng)基(另加0.1 g/L納他霉素和1 g/L CaCO3)于37 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束，取30～300菌落的平皿計數(shù)，并選取優(yōu)勢細菌(>5 log CFU/g)進一步分離。根據(jù)菌落外觀結合光學顯微鏡鑒定，挑取具有一定形態(tài)差異的菌株，轉(zhuǎn)接至對應液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)完畢后短暫離心獲得菌液沉淀。

參照試劑盒說明書，提取優(yōu)勢細菌基因組DNA，通過引物27F/1492R擴增16S rRNA 基因，引物序列及擴增參數(shù)參照文獻[19]。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳驗證合格，送至生工生物工程公司測序。測序結果經(jīng)拼接處理，通過NCBI網(wǎng)站的BLAST在線程序比對。通過MEGA軟件采用最大簡約法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,聚類樹節(jié)點的置信度采用1 000次自舉法[20]。

1.3.4 豆豉微生物宏基因的提取

等量稱取各豆豉樣品，使用無菌磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌3次，將豆豉樣品洗脫下的物質(zhì)用無菌雙層紗布過濾。收集的濾液于4 ℃離心后棄上清液，參照試劑盒說明書完成宏基因提取。提取完畢，通過10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳及超微量分光光度計評估宏基因的完整性、濃度及污染程度。

1.3.5 PCR擴增與上機測序

以合格的豆豉宏基因為模板，采用含Barcode標簽的引物338F/806R對細菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)域進行PCR擴增，引物序列及擴增參數(shù)參照文獻[12]。取少量擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳初步評估后，利用凝膠回收試劑盒完成回收。通過超微量分光光度計評估擴增產(chǎn)物的濃度及污染程度，所有樣品均合格后，統(tǒng)一各樣品的DNA總量后測序。上機測序使用的Hiseq 2500平臺，采取雙末端測序策略(150 bp×2)，測序委托諾禾致源科技公司完成。

1.3.6 高通量測序數(shù)據(jù)的處理

獲得原始序列后，通過FLASH、USEARCH和UCHIME軟件獲得不含嵌合體的tags序列。通過USEARCH軟件在相似性97%的水平聚類OTU,以序列總數(shù)的0.005%為閾值過濾OTU[21]。序列經(jīng)RDP Classifier軟件比對Silva數(shù)據(jù)庫(置信度閾值=0.8)[22]完成物種注釋。采用mothur 軟件計算細菌群落Alpha多樣性指數(shù)；采用QIIME軟件對細菌群落結構進行主坐標分析(principal coordinates analysis,PCoA)分析。通過Lefse軟件分析各組間屬水平上的標志生物(Biomaker)，設置線性判別的得分篩選值為4[23]。參考KEGG數(shù)據(jù)庫，通過PICRUSt軟件進行豆豉樣品的細菌基因功能預測。

1.4 統(tǒng)計分析與數(shù)據(jù)提交

試驗結果以平均值±標準差表示，樣品差異分析采用單因素方差法，差異顯著(P<0.05)時通過Duncan氏法進行多重比較，分析由SPSS 24.0軟件完成。

本文涉及18樣品的原始序列已上傳至NCBI網(wǎng)站SRA(Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫，項目檢索號：SRP262092。

2 結果與分析

2.1 兩種豆豉發(fā)酵過程中重要理化因子的比較

就重要的理化因子來看(圖1)，2種豆豉的pH值均持續(xù)下降，其中快速工藝下降較快，到發(fā)酵第7天即降至4.67；而傳統(tǒng)工藝的pH下降偏慢，至發(fā)酵第7天仍為5.61，最終pH值為4.91。兩者發(fā)酵中均采用人工控溫策略，其中快速發(fā)酵工藝大都高達50～60 ℃，于第4天達到57.6 ℃的峰值，而傳統(tǒng)工藝大都在40～50 ℃，最高溫度為47.5 ℃。另外，由于發(fā)酵前未拌鹽，快速工藝豆豉最高的NaCl含量僅為0.42%，而拌鹽后的傳統(tǒng)工藝豆豉NaCl含量最高為6.41%，因兩者表面均覆蓋鹽層，發(fā)酵中鹽層的逐步溶解，使得兩者NaCl含量均小幅上升。

圖1 兩種豆豉發(fā)酵過程中重要理化因子的變化Fig.1 Changes of vital physicochemical factors of two types of Douchi during fermentation

2.2 兩種豆豉發(fā)酵過程中可培養(yǎng)微生物的比較

2.2.1 可培養(yǎng)微生物的豐度

經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)發(fā)現(xiàn)(圖2)，2種工藝下豆豉可培養(yǎng)微生物的總量均呈下降趨勢，而同時期傳統(tǒng)工藝豆豉各類微生物的豐度更高(P<0.05)。具體來看，快速工藝下，各類微生物數(shù)目穩(wěn)步下降，細菌由初期7.16 log CFU/g下降至末期的3.76 log CFU/g，而真菌、乳酸菌初期僅各為4.05和3.43 log CFU/g，末期甚至均未能分離。就傳統(tǒng)工藝而言，細菌也占據(jù)著統(tǒng)治地位，各階段數(shù)目分別為7.71、7.04和6.24 log CFU/g；真菌的數(shù)目最高僅為5.35 log CFU/g，相較于細菌，其在各階段的數(shù)目均約低3個數(shù)量級；而從乳酸菌群體來看，其在初期達到6.85 log CFU/g,但在發(fā)酵中末期則均低于4 log CFU/g。

圖2 兩種豆豉發(fā)酵過程中可培養(yǎng)微生物的豐度變化Fig.2 Changes in the abundance of cultured microbes of two types of Douchi during fermentation注：不同的字母標注表示具顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2.2 優(yōu)勢細菌的鑒定

由于2類工藝下豆豉中細菌的豐度均占絕對優(yōu)勢，為此后續(xù)重點選取優(yōu)勢細菌進行分離鑒定。分子鑒定的結果如圖3所示，22株優(yōu)勢細菌可歸為5個菌屬下的7個種，其中2種為乳酸菌。從各菌種的分布來看，貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)分布最為廣泛，且在傳統(tǒng)工藝的各時期均為優(yōu)勢菌，而同屬的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)僅在2種工藝的發(fā)酵初期為優(yōu)勢菌。就特有優(yōu)勢菌而言，傳統(tǒng)工藝下包括4種，分別為雞葡萄球菌(Staphylococcusgallinarum)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)、泰國魏斯氏菌(Weissellathailandensis)及發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，分布于發(fā)酵初期及中期；與前者形成鮮明對照的是，快速工藝下特有優(yōu)勢菌僅為球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus)，且其僅在發(fā)酵初期出現(xiàn)。

圖3 豆豉樣品中優(yōu)勢細菌的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of dominant bacteria in Douchi samples

2.3 兩種豆豉發(fā)酵過程中細菌群落高通量測序的比較

2.3.1 豆豉細菌的Alpha多樣性

對測序樣品進行Alpha多樣性分析后發(fā)現(xiàn)(表1)，各豆豉樣品的覆蓋率(Coverage)>99.5%，說明測序中關鍵的物種信息已獲得。就各項Alpha多樣性指數(shù)來看，快速工藝下豆豉的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)整體低于傳統(tǒng)工藝(P<0.05)，說明傳統(tǒng)工藝下細菌物種豐度即物種數(shù)量更多。而就Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)的分布來看，快速工藝與傳統(tǒng)工藝則各有高低，但在傳統(tǒng)工藝發(fā)酵第1天，兩者的比值達到最大，表明此時物種多樣性的程度最高。

表1 兩種豆豉各樣品細菌的Alpha多樣性指數(shù)Table 1 The Alpha diversity indexs of fermented bacteria in two types of Douchi samples

2.3.2 豆豉細菌的物種組成

測序數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，18個樣品的測序信息共歸為947個OTU，并獲得由門至屬水平的物種注釋信息。從門水平的物種組成來看(圖4)，2種工藝下，厚壁菌門(Firmicutes)均是絕對優(yōu)勢門，雖然在傳統(tǒng)工藝豆豉中，其占比相對更低，但最低相對豐度亦達到70.86%。其他主要門(平均相對豐度>1%)僅包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)，其中快速工藝下，變形菌門的平均占比僅為1.38%，放線菌門更是均低于0.01%。相比之下，傳統(tǒng)工藝下2門的比例明顯更高，其中放線菌門在初期、中期相對豐度更高，而變形菌門更多地集中于末期，最高達到25.42%的占比。

圖4 兩種豆豉各樣品門水平上細菌的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria in two types of Douchi samples at phylum level注:不同字母標注(a、b、c)表示同1個樣品3組平行，圖5同

具體到屬水平上，2類豆豉在主要屬(平均相對豐度>1%)組成及演替上表現(xiàn)出更大差異(圖5-a)。在快速工藝豆豉中，芽孢桿菌屬(Bacillus)占據(jù)絕對優(yōu)勢，其相對豐度為先升后降，在發(fā)酵第4天最高達96.91%；而次優(yōu)勢屬包括賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等，其中賴氨酸芽孢桿菌屬在第1天最高達48.28%。就傳統(tǒng)工藝而言，葡萄球菌屬(Staphylococcus)全程占據(jù)優(yōu)勢，其相對豐度亦為先升后降，于發(fā)酵第7天最高達到88.82%的占比；其他次優(yōu)勢屬主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、魏斯氏菌屬(Weissella)、片球菌屬(Pediococcus)等，值得注意的是，傳統(tǒng)工藝下芽孢桿菌屬的占比遠不及快速工藝，其平均相對豐度僅為1.99%。另外，就2種工藝豆豉的菌屬組成差異來看(圖5-b)，兩者共有屬達到38種，其中傳統(tǒng)工藝下特有屬的種類較快速發(fā)酵更多，而兩者特有屬的相對豐度和均未能超過5%。

a-相對豐度;b-韋恩圖圖5 兩種豆豉各樣品屬水平上細菌的分布特征Fig.5 Distribution characteristics of bacteria in two types of Douchi samples at genus level

2.3.3 豆豉細菌結構的差異分析

未加權的PCoA表明(圖6-a)，PC1與PC2兩主軸解釋度和為75.08%，說明其已能夠反映樣品中大部分信息。就各樣品分布來看，快速工藝與傳統(tǒng)工藝樣品相隔較遠，占據(jù)著不同象限，表明兩者菌群結構差異明顯。而就同種豆豉來看，快速工藝樣品分布整體較散，同一時期樣品距離也較長，說明不同采樣區(qū)域或發(fā)酵時期，其菌群結構均存在一定差別；而傳統(tǒng)工藝樣品雖整體也較為分散，但在同一時期分布較為密集，說明樣品間差異更多來源于不同發(fā)酵時期之間。另外，結合Lefse分析后發(fā)現(xiàn)(圖6-b)，在屬水平上，快速工藝豆豉的5種標識屬多數(shù)為賴氨酸芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬等優(yōu)勢屬，且發(fā)酵初期和末期的標志屬較多；而傳統(tǒng)工藝豆豉標志屬的數(shù)目更多(9種)，其中發(fā)酵初期的標志屬有3種可歸為乳酸菌，發(fā)酵末期更多是一些非優(yōu)勢屬，如鞘脂桿菌屬(Sphingobacterium)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)等。

a-PcoA；b-Lefse圖6 兩種豆豉各樣品細菌結構的差異Fig.6 Structural differences of bacteria in two types of Douchi samples

2.3.4 豆豉細菌基因的PICRUSt 功能預測

細菌基因功能預測的結果表明，在6類一級功能通路中(圖7-a)，注釋到代謝(metabolism)、遺傳信息處理(genetic information processing)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)更多，其中注釋為代謝的基因占比均超過60%。與快速工藝相比，傳統(tǒng)工藝下細菌基因注釋到代謝、遺傳信息處理的比例明顯更高，注釋到環(huán)境信息處理則明顯更低(P<0.05)。在二級水平進一步注釋后發(fā)現(xiàn)(圖7-b)， 47個二級功能通路中，主要的功能通路有14個(相對豐度>2%)，較多注釋到碳代謝(carbohydrate metabolism)、全局概覽(global and overview maps)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)等類別。就傳統(tǒng)工藝對照來看，快速工藝下核酸代謝(nucleotide metabolism)、翻譯(translation)及復制與修復(replication and repair)等通路的豐度明顯更低，而關于信號轉(zhuǎn)導(signal transduction)的通路豐度則明顯更高(P<0.05)。

a-一級水平;b-二級水平圖7 兩種豆豉各樣品細菌基因功能預測的分布Fig.7 Distribution of bacterial gene function prediction in two types of Douchi samples

3 討論

豆豉的發(fā)酵環(huán)境可看作一種人為創(chuàng)設的微生物生態(tài)系統(tǒng)[24]，即豆豉微生態(tài)。不同工藝下理化因子(溫度、拌鹽量、pH等)是豆豉微生態(tài)的重要組成，而豆豉微生物本質(zhì)上是對發(fā)酵環(huán)境適應的體現(xiàn)。為此，本研究在比較2種工藝下菌群變化差異之前，針對性選取pH、含鹽量、溫度等理化因子進行了測定。研究發(fā)現(xiàn)，2種工藝下豆豉的pH在發(fā)酵中均穩(wěn)步下降，其變化趨勢與胡會萍等[25]報道一致。而傳統(tǒng)工藝的含鹽量約為6%，快速工藝更是不足1%，均不及陽江、永川等傳統(tǒng)高鹽豆豉[4]，但2種工藝的發(fā)酵溫度較上述傳統(tǒng)高鹽豆豉均明顯更高并且成熟時間更短，雖然高溫不利于菌群自身的生長代謝，但相對高溫(50 ℃上下)可加快發(fā)酵中原料的酶促分解及化學反應速率[26-27]，這或是快速工藝豆豉發(fā)酵期更短的重要原因。

可培養(yǎng)法的結果表明，2種工藝下菌群的總豐度均持續(xù)下降，而真菌豐度均遠低于細菌豐度，其他學者[6, 28]結合可培養(yǎng)法分離得到更多發(fā)酵菌株，同時也發(fā)現(xiàn)豆豉發(fā)酵中的細菌占據(jù)絕對優(yōu)勢。這一方面或因制曲中的真菌經(jīng)洗曲環(huán)節(jié)被大量去除，真菌較長的培養(yǎng)周期進一步限制其豐度的上升速率；更大可能則是在缺氧、高溫的環(huán)境下，曲霉等主要真菌的增殖遠不如一些細菌屬活躍，由此奠定細菌在發(fā)酵中的絕對優(yōu)勢地位。而就分離的優(yōu)勢菌種來看，球形賴氨酸芽孢桿菌在以往豆豉的相關研究未見報道，但CHETTRI等[29]在當?shù)匕l(fā)酵豆制品中分離到多株該菌。其他6種優(yōu)勢菌種在前人的分離試驗中則常作為豆豉發(fā)酵優(yōu)勢菌存在[7, 30]，且CHEN等[10]針對豆豉制曲階段分離的細菌也有3種與本研究傳統(tǒng)工藝一致，這進一步說明發(fā)酵中的部分優(yōu)勢菌或由制曲階段帶入。

就豆豉細菌的高通量測序來看，不同于部分報道對真菌、細菌均進行測序[12-13]，本研究重點僅就豆豉細菌的演替展開比較。一方面是由于可培養(yǎng)試驗已表明2種工藝下細菌豐度均占絕對優(yōu)勢，另一方面本課題組過去已探明豆豉發(fā)酵中真菌結構的波動較小，且優(yōu)勢屬僅含曲霉、橫梗霉2種[12]。為此，從細菌的整體組成看，高通量測序結果表明2類豆豉中共含53個細菌屬，該數(shù)目遠遠超過可培養(yǎng)法中優(yōu)勢細菌的種類，而應用DGGE技術的相關研究僅可對豆豉優(yōu)勢菌株(約1%以上)進行分析[9-10]。從門水平來看，厚壁菌門在3個主要門中占據(jù)絕對優(yōu)勢，而厚壁菌門在以往曲霉型、細菌型豆豉的研究中也均歸為強優(yōu)勢門[11-13]，其占比大都在80%以上，且放線菌門、變形菌門亦占據(jù)較小比例，這與本文的結果大體一致。具體到屬水平上，本次測序中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢屬在培養(yǎng)試驗中也被歸為優(yōu)勢細菌，說明2種探究手段的結果形成一定程度地互證。

而從2種工藝優(yōu)勢屬的差異來看，快速工藝的特有優(yōu)勢屬包括芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬3種，其中芽孢桿菌屬在以往豆豉的相關報道最多。如ZHANG等[31]發(fā)現(xiàn)甘肅兩地豆豉的優(yōu)勢屬均為芽孢桿菌屬，其中隴南產(chǎn)地的豆豉中芽孢桿菌屬的占比約為70%，這與本文快速工藝發(fā)酵末期該屬的比例相近，而石聰?shù)萚13]亦發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在瀏陽豆豉發(fā)酵中占據(jù)全程優(yōu)勢，且芽孢桿菌屬在其他高溫下發(fā)酵的食品也常作為優(yōu)勢屬存在[32]。而就傳統(tǒng)工藝而言，葡萄球菌屬是唯一全程優(yōu)勢屬，這與本課題組的研究[12]總體一致，其他學者在曲霉型豆豉[9]、細菌型豆豉[5,31]中雖也發(fā)現(xiàn)該屬的存在，但大都為次優(yōu)勢菌的角色，此外，該屬在其他鹽分較高的發(fā)酵食品如豆醬[33]、香腸[34]中也占據(jù)優(yōu)勢地位；而包括魏斯氏菌屬、乳桿菌屬等在內(nèi)的乳酸菌則廣泛分布于豆豉[9,11-12]、豆醬[33]、泡菜[16]等諸多的常溫發(fā)酵食品。結合主要的理化因子可以發(fā)現(xiàn)，除去共有的偏酸、低氧屬性，快速工藝下豆豉細菌更多地面臨高溫脅迫，傳統(tǒng)工藝下則是關于鹽分、中高溫的耐受考驗。為此，2種工藝下，由于芽孢桿菌較強的高溫耐受力、葡萄球菌較強的鹽分耐受力，故兩者分別維持著以芽孢桿菌、葡萄球菌為全程優(yōu)勢菌的局面，乳酸菌則僅集中于傳統(tǒng)工藝溫度較低的初期。值得注意的是，快速工藝下增殖相關的基因通路占比更少，其中發(fā)酵初期的細菌豐度及多樣性更高，說明菌群在溫度較低的初期更多地參與實質(zhì)發(fā)酵進程。雖有研究表明部分芽孢桿菌在60 ℃以上仍具一定產(chǎn)酶能力[35]，但高溫往往可讓多數(shù)菌群維持低活性或芽孢狀態(tài)，表明發(fā)酵中后期或由殘余酶的酶促分解及化學反應占主導，這可能不利于該工藝下豆豉風味的持續(xù)形成。因此，未來有必要結合代謝組學，對快速工藝豆豉的發(fā)酵溫度、發(fā)酵周期等參數(shù)進一步改進。