基于1 046例肺癌靶向基因檢測(cè)的ARMS-PCR和NGS技術(shù)優(yōu)勢(shì)分析

朱麗蒙，馬楠，任曉妮，張暋

(鄭州金域臨床檢驗(yàn)中心有限公司 實(shí)驗(yàn)診斷部，河南 鄭州 450000)

突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)-鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(amplification refractory mutation system-PCR，ARMS-PCR)技術(shù)和下一代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)是目前臨床上常用的兩種靶向基因突變檢測(cè)方法。ARMS-PCR具有高靈敏度和高特異性，突變檢出率遠(yuǎn)超傳統(tǒng)的PCR，已成為腫瘤個(gè)體化分子檢測(cè)最普遍、最重要的技術(shù)之一[1]。另一方面，NGS以邊合成邊測(cè)序?yàn)樵?，具有通量高、檢測(cè)類型多樣的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床肺癌靶向基因檢測(cè)[2]。NCCN建議，臨床非小細(xì)胞肺癌靶向治療前采用ARMS-PCR或NGS技術(shù)進(jìn)行基因突變檢測(cè)，包括EGFR、KRAS、BRAF、MET、RET基因突變和ALK、ROS1和NTRK基因重排等。不同場(chǎng)景下，如何選擇合適的檢測(cè)技術(shù)是臨床常面臨的問題[3]。本研究基于1 046例肺癌靶向基因檢測(cè)樣本的結(jié)果統(tǒng)計(jì)，對(duì)比闡述ARMS-PCR和NGS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，幫助臨床醫(yī)生在肺癌靶向治療中有效選擇相應(yīng)的檢測(cè)方法，避免時(shí)間和資源的浪費(fèi)。

1 材料和方法

1.1 材料選取2018年1月至2020年3月從河南省內(nèi)各地區(qū)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)送至鄭州金域臨床檢驗(yàn)中心有限公司檢測(cè)肺癌靶向基因的病例。排除資料不清或診斷不明的，篩選出1 046例樣本，臨床診斷結(jié)果均為疑似或確診肺癌，年齡30～90歲，年齡中位數(shù)67歲，男554例，女492例。樣本類型包括活檢組織的石蠟包埋組織(formalin fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)、新鮮血漿。將FFPE樣本772例按檢測(cè)方法分為兩組：NGS方法329例，ARMS-PCR方法443例；將游離血漿樣本274例按檢測(cè)方法分為兩組：NGS方法83例，ARMS-PCR方法191例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法ARMS-PCR技術(shù)平臺(tái)采用ABI 7500 熒光定量擴(kuò)增儀，組織樣本核酸提取試劑盒為QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (貨號(hào)：56404)，游離血漿核酸提取試劑盒為QIAamp ccfDNA/RNA Kit(貨號(hào)：55184)，PCR檢測(cè)試劑盒涵蓋G719S、G719C、G719A、S768I、T790M、L858R、L861Q等7個(gè)突變位點(diǎn)和29個(gè)19號(hào)外顯子缺失突變。數(shù)據(jù)質(zhì)控指標(biāo)為：組織樣本內(nèi)參Ct值為14～19，游離血漿內(nèi)參Ct值<28。

NGS技術(shù)以邊合成邊測(cè)序?yàn)樵?，通過(guò)對(duì)PCR分子簇上堿基連接的熒光信號(hào)進(jìn)行捕獲，并轉(zhuǎn)換為堿基信息。靶向區(qū)域測(cè)序是指針對(duì)目的基因的特定區(qū)域進(jìn)行NGS測(cè)序，通過(guò)探針雜交捕獲或PCR擴(kuò)增，將基因的靶向區(qū)域構(gòu)建成特定大小范圍的DNA或cDNA片段文庫(kù)，再對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析[4]。NGS技術(shù)平臺(tái)采用Illumina NextSeq 550儀器，KAPA構(gòu)庫(kù)試劑，IDT定制靶向基因探針，Illumina上機(jī)試劑(貨號(hào)：FC-404-2004)；定制探針覆蓋22個(gè)靶向基因的全外顯子，可檢測(cè)的突變類型有點(diǎn)突變和小片段插入/缺失、剪切子變異、拷貝數(shù)變異和4個(gè)基因的重排，22個(gè)基因包括AKT1、ALK、BRAF、CTNNB1、DDR2、EGFR、ERBB4、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、KRAS、MAP2K1、MET、NOTCH1、NRAS、PIK3CA、PTEN、SMAD4、STK11、TP53；基因重排包括ALK重排、RET重排、ROS1重排、NTRK1重排。數(shù)據(jù)經(jīng)生信分析成突變注釋表，質(zhì)控指標(biāo)：Q30>0.85，捕獲特異性>65%，靶向區(qū)域覆蓋度>99%，去重后深度大于500X的靶向區(qū)域>90%。基因突變報(bào)告參考ACMG解讀標(biāo)準(zhǔn)[2]以及ACMG的意外發(fā)現(xiàn)變異的指南[3]，Ⅰ類變異為有致病意義、Ⅱ類變異為潛在致病意義、Ⅲ類變異為致病意義未明，均應(yīng)報(bào)告為檢出突變[5-6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)比較NGS技術(shù)和ARMS-PCR技術(shù)檢測(cè)EGFR基因主要突變位點(diǎn)的檢出率和總檢出率，分析NGS方法和ARMS-PCR方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌靶向基因的變異類型的特點(diǎn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FFPE樣本EGFR基因已知位點(diǎn)突變檢出率NGS技術(shù)與ARMS-PCR技術(shù)對(duì)FFPE樣本EGFR基因已知位點(diǎn)突變總檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ARMS-PCR技術(shù)對(duì)FFPE樣本外顯子18(G719X)、外顯子20(T790M)、外顯子19(缺失突變)、外顯子21(L861Q)、外顯子20(S768I)突變的檢出率分別與NGS技術(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ARMS-PCR技術(shù)對(duì)外顯子21(L858R)突變的檢出率高于NGS技術(shù)(P<0.05)。見表1。

表1 NGS技術(shù)和ARMS-PCR技術(shù)對(duì)FFPE樣本EGFR基因已知位點(diǎn)檢出率比較[n(%)]

2.2 血漿樣本EGFR基因主要位點(diǎn)突變檢出率NGS技術(shù)與ARMS-PCR技術(shù)對(duì)血漿樣本EGFR基因主要位點(diǎn)突變總檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ARMS-PCR技術(shù)對(duì)血漿樣本外顯子20(T790M)、外顯子19(缺失突變)、外顯子21(L858R)突變的檢出率分別與NGS技術(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 NGS技術(shù)和ARMS-PCR技術(shù)對(duì)血漿樣本EGFR基因主要位點(diǎn)檢出率比較[n(%)]

2.3 NGS技術(shù)檢測(cè)肺癌EGFR基因未知/罕見突變NGS方法檢出EGFR基因擴(kuò)增16例，檢出率4.89%(16/329)，另外檢出1例與L858R突變同時(shí)發(fā)生的C797S/T790M順式變異，提示患者對(duì)三代EGFR-TKI耐藥。見表3。

表3 NGS技術(shù)對(duì)FFPE樣本EGFR基因未知/罕見突變的檢出情況(n)

2.4 NGS技術(shù)檢測(cè)肺腺癌和肺鱗癌多基因突變譜NGS檢測(cè)肺癌靶向基因套餐的FFPE樣本中，214例確診為肺腺癌，34例確診為肺鱗癌。與肺腺癌比較，NGS技術(shù)對(duì)FFPE樣本肺鱗癌TP53和PIK3CA基因突變檢出率較高，對(duì)EGFR基因突變檢出率較低(P<0.05)。NGS技術(shù)對(duì)FFPE樣本肺鱗癌PTEN、KRAS、CTNNB1、MET、SMAD4、BRAF基因突變檢出率分別與肺腺癌中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ERBB2、ALK融合、RET融合、ROS1融合4個(gè)基因肺鱗癌例數(shù)為0，暫不做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。見表4。

表4 NGS技術(shù)對(duì)FFPE樣本肺腺癌和肺鱗癌多基因突變檢出率比較[n(%)]

3 討論

ARMS-PCR與NGS技術(shù)都是由普通PCR發(fā)展和衍生出來(lái)用于檢測(cè)基因信息的技術(shù)，ARMS-PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于高特異性和靈敏度，理想狀態(tài)下，靈敏度可達(dá)0.5%[1]。因此，可以解釋ARMS-PCR方法檢測(cè)FFPE樣本的L858R突變有更高的檢出率。從原理上來(lái)說(shuō)，NGS技術(shù)在生物信息分析的過(guò)程中可能有一定的錯(cuò)誤率[7]，但是，通過(guò)提高二代測(cè)序的測(cè)序深度可降低錯(cuò)誤率，提高靈敏度，從而可達(dá)到與ARMS-PCR一致的整體檢出率。檢測(cè)血漿、胸腔積液、腦脊液等體液中的游離循環(huán)DNA(free circulating DNA，cfDNA)，被稱作液體活檢。釋放在體液中的腫瘤細(xì)胞被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor DNA，ctDNA)，血漿內(nèi)質(zhì)量濃度只有5～10 μg·L-1，要求檢測(cè)技術(shù)有較高的靈敏度和特異性。NGS技術(shù)檢測(cè)血漿樣本核酸時(shí)，會(huì)在上機(jī)前設(shè)計(jì)較高的數(shù)據(jù)量(一般為蠟塊樣本的10倍以上數(shù)據(jù)量)，以便達(dá)到足夠高的測(cè)序深度，從而提高檢測(cè)的靈敏度。由此可知，在石蠟包埋樣本和血漿樣本中，ARMS-PCR的檢出率與引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增條件有關(guān)，而NGS技術(shù)的檢出率會(huì)受測(cè)序深度影響，在兩者條件優(yōu)化的情況下，可能使總檢出率達(dá)到一致。本研究結(jié)果顯示，NGS技術(shù)與ARMS-PCR技術(shù)對(duì)EGFR基因總檢出率無(wú)明顯差異。受檢測(cè)條件的影響，某些位點(diǎn)的檢出率可能有所變化，如本研究中ARMS-PCR技術(shù)對(duì)EGFR基因L858R突變的檢出率高于NGS技術(shù)。

本研究結(jié)果中，ARMS-PCR檢測(cè)到EGFR基因點(diǎn)突變和基因小片段缺失；NGS方法檢測(cè)到更多EGFR基因的突變類型，包括基因小片段插入、拷貝數(shù)變異、基因融合等。根據(jù)NGS測(cè)序結(jié)果，可判斷出雙突變是順式(位于同一等位基因上)，還是反式(位于不同等位基因上)。對(duì)于C797S/T790M雙突變，順式和反式有截然相反的臨床意義，即順式對(duì)EGFR-TKI靶向治療耐藥，而反式對(duì)EGFR-TKI靶向治療敏感[8]。從原理上來(lái)說(shuō)，ARMS-PCR技術(shù)也可以用于定量檢測(cè)RNA水平的拷貝數(shù)變異，預(yù)測(cè)蛋白表達(dá)水平是否增高，或用于檢測(cè)RNA水平的基因重排。然而，由于肺癌蠟塊組織樣本提取RNA碎片化較嚴(yán)重，檢測(cè)有一定難度，目前尚無(wú)成熟試劑盒應(yīng)用于臨床。NCCN指南更推薦熒光原位雜交技術(shù)(FISH)用于ALK和ROS1基因重排的檢測(cè)[3]。采用NGS技術(shù)檢測(cè)基因重排，可通過(guò)基因比對(duì)，推測(cè)基因斷裂和重排位點(diǎn)，預(yù)估重排的突變頻率，用于臨床時(shí)，常與FISH結(jié)果相互驗(yàn)證。NGS技術(shù)也可以檢測(cè)到DNA片段的拷貝數(shù)，其用生物信息分析的方法，計(jì)算出拷貝數(shù)增多或減少，預(yù)測(cè)蛋白是否過(guò)表達(dá)，臨床上常用FISH技術(shù)或免疫組化進(jìn)行驗(yàn)證[9]。在肺癌靶向治療檢測(cè)中，NGS比ARMS-PCR技術(shù)的通量高，檢測(cè)范圍廣，當(dāng)臨床活檢樣本較少時(shí)，可以一次性獲得更多基因突變信息，為臨床提供更全面的治療依據(jù)。

臨床可根據(jù)基因突變譜對(duì)癌種進(jìn)行輔助診斷和分型。EGFR基因突變、ALK融合和ROS1融合可指導(dǎo)臨床選用相應(yīng)的靶向藥。在本研究中，NGS技術(shù)檢測(cè)肺腺癌和肺鱗癌表現(xiàn)出不同的基因突變譜。肺鱗癌對(duì)EGFR-TKI靶向治療的效果不佳[10]，故臨床上肺癌靶向基因檢測(cè)多用于肺腺癌患者的用藥指導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌中EGFR基因突變檢出率高于肺鱗癌。NGS肺癌檢測(cè)套餐還可同時(shí)檢測(cè)KRAS、PTEN、PIK3CA、ERBB2等基因突變，在治療前、治療中、治療后監(jiān)測(cè)是否有原發(fā)或繼發(fā)的耐藥突變，指導(dǎo)臨床優(yōu)化用藥方案。本研究中，TP53基因是突變檢出率最高的基因。TP53是典型的抑癌基因，TP53基因失活突變是肺癌預(yù)后不良的標(biāo)志[11]。NGS因高通量的特點(diǎn)常被作為大規(guī)模人群基因組檢測(cè)項(xiàng)目的技術(shù)手段，以幫助研究人員了解種群之間的突變譜差異，檢出未知突變，便于發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變與不同疾病和治療之間的關(guān)系，用于疾病的診斷和新靶向藥物的開發(fā)。但是，ARMS-PCR技術(shù)無(wú)法檢測(cè)基因突變譜。

NGS檢測(cè)時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本比較高。一般的肺癌靶向基因NGS檢測(cè)流程包括核酸提取、構(gòu)建DNA文庫(kù)、靶向捕獲、上機(jī)檢測(cè)、生物信息學(xué)分析、突變意義分析和報(bào)告等步驟，需耗時(shí)3～5 d。再加上價(jià)格高昂的儀器和上機(jī)試劑，對(duì)于基層醫(yī)院來(lái)說(shuō)，設(shè)備及項(xiàng)目的推廣存在困難。而ARMS-PCR雖然只常用于檢測(cè)已知位點(diǎn)，但其實(shí)驗(yàn)流程只需要核酸提取、試劑配制、上機(jī)檢測(cè)、結(jié)果報(bào)告，全程可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。儀器和試劑價(jià)格也易于接受，利于臨床項(xiàng)目的開展。

綜上，若臨床所需檢測(cè)的突變都在已知范圍內(nèi)，可選擇ARMS-PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行位點(diǎn)檢測(cè)。ARMS-PCR技術(shù)特異性高，靈敏度高，適用于已知突變靶向用藥效果檢測(cè)和痕量殘留突變的檢測(cè)，由于其設(shè)備及試劑成本低，實(shí)驗(yàn)流程時(shí)間短，操作方便，易于在基層醫(yī)院推廣；NGS靶向測(cè)序技術(shù)操作復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，成本較高，但是其檢測(cè)通量高，范圍廣，適合于用藥方案制定初期的靶向基因篩查，制定用藥方案；病程變化時(shí)，可使用NGS技術(shù)篩查是否有新發(fā)的耐藥基因突變，優(yōu)化用藥方案，以及評(píng)估預(yù)后等。同時(shí)，NGS作為一種臨床研究的手段，可以用于繪制種群突變譜，發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變，總結(jié)突變與疾病發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，為開發(fā)新的快速診斷方法、新的靶向藥物提供依據(jù)。對(duì)于ARMS-PCR和NGS兩種檢測(cè)技術(shù)，臨床可根據(jù)檢測(cè)目的和病程，采用適合的檢測(cè)項(xiàng)目或套餐。