TIMD4在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)與臨床意義

張通，楊平，魏健昌，曾山崎，陳華翠，鐘俊斌，王強(qiáng)，李旺林，魏芳，曹杰

(廣州市第一人民醫(yī)院/廣州消化疾病中心/華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院 結(jié)直腸肛門(mén)外科，廣東 廣州 510180)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，在世界范圍內(nèi)成為第4位致死的腫瘤性疾病[1]。我國(guó)CRC發(fā)病率和死亡率均位于所有腫瘤第5位[2]。手術(shù)、化療和放療是CRC的主要治療手段，但CRC患者的總生存率卻沒(méi)有顯著提高，亟待尋找新的治療手段[3]。腫瘤和免疫反應(yīng)的相互作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3-4]，增強(qiáng)和促進(jìn)人體免疫反應(yīng)對(duì)腫瘤患者來(lái)說(shuō)是一種有效的治療手段[5]。TIM家族在腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)先天及后天免疫細(xì)胞，有助于腫瘤的免疫監(jiān)視和抗腫瘤的免疫反應(yīng)，從而提高腫瘤的臨床治療效果[6]。TIMD4是TIM家族成員之一[6]。研究顯示，TIMD4能夠調(diào)節(jié)免疫功能及抗腫瘤的免疫反應(yīng)，通過(guò)抑制腫瘤相關(guān)抗原活性，引起腫瘤微環(huán)境免疫耐受，從而抑制免疫活性[7-9]。本研究旨在進(jìn)一步探討TIMD4蛋白在CRC中的表達(dá)情況及其臨床意義，為今后患者預(yù)后的預(yù)測(cè)和臨床干預(yù)效果的評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料The cancer genome atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)。組織芯片(No. co2161)包含208例結(jié)腸癌和8例正常結(jié)腸組織，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)西安艾麗娜生物科技有限公司，附有所有患者的相關(guān)臨床資料。PV-6000通用型免疫組化試劑盒購(gòu)自北京欣興唐生物科技有限公司，DAB顯色液購(gòu)自福州邁新試劑。兔抗人多克隆TIMD4抗體(HPA015625)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司。光學(xué)顯微鏡購(gòu)買(mǎi)于日本Olypmus公司。PBS緩沖液、蘇木精、酒精，二甲苯、封片用樹(shù)膠由廣州市第一人民醫(yī)院病理科提供。

1.2 免疫組化采用免疫組化PV兩部法：組織芯片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)浸泡5 min，微波微火抗原修復(fù)3 min，共2次，自然冷卻至室溫，體積分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，10 min，PBS沖洗，以1∶100比例滴加TIMD抗體，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗滴加通用型二抗(PV-6000)，37 ℃溫箱孵育40 min，PBS沖洗，二氨甲聯(lián)苯胺顯色，自來(lái)水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。

1.3 表達(dá)評(píng)分組織芯片掃描后使用ImageScope 11軟件分析，2名病理醫(yī)生分別以半定量方式對(duì)TIMD4表達(dá)進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)定：無(wú)為0分，弱為1分，中為2分，強(qiáng)為3分。染色百分比：0～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分?？偡钟扇旧珡?qiáng)度和百分比得分相加確定?？偡?4分為高表達(dá)，總分≤4分為低表達(dá)[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。TIMD4表達(dá)水平和臨床病理特征的關(guān)系采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)?？偵娣治霾捎肒aplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)。單因素和多因素分析采用Cox回歸。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TIMD4mRNA表達(dá)與CRC侵犯層次的關(guān)系TIMD4mRNA高表達(dá)與較深CRC侵犯層次相關(guān)(P=0.020)。TIMD4蛋白高表達(dá)與低病理分級(jí)(P=0.046)、高臨床分期(P<0.001)、深侵犯層次(P<0.001)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.001)相關(guān)。見(jiàn)表1。

2.2 CRC中TIMD4蛋白表達(dá)的情況采用免疫組化檢測(cè)CRC組織芯片(208例癌組織、8例正常組織)TIMD4蛋白表達(dá)，進(jìn)一步探討TIMD4蛋白表達(dá)及其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。圖1A示組織芯片中各樣本TIMD4蛋白表達(dá)情況。組織芯片原有208例CRC組織，免疫組化染色過(guò)程中部分CRC脫蠟，最終實(shí)驗(yàn)獲得197例CRC染色。TIMD4蛋白在CRC中表達(dá)高于正常組織(P<0.01)(圖1B)。圖1C～1E顯示TIMD4蛋白主要表達(dá)于CRC和正常組織腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。

2.3 TIMD4高表達(dá)是CRC患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素采用Kaplan-Meier方法比較TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)192例CRC患者中TIMD4高表達(dá)和低表達(dá)患者的總體生存時(shí)間。根據(jù)TIMD4mRNA表達(dá)量平均值將樣本分為T(mén)IMD4高表達(dá)組和低表達(dá)組[10]。TIMD4高表達(dá)組和低表達(dá)組患者術(shù)后的總生存時(shí)間分別為(40.10±6.75)和(48.54±2.95)個(gè)月。TIMD4高表達(dá)CRC患者術(shù)后總生存時(shí)間較TIMD4低表達(dá)者短(Log-rank=4.549，P=0.033)。見(jiàn)圖2。單因素分析顯示，TIMD4高表達(dá)是CRC患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)因素(HR：2.272，95% CI：1.041～7.116，P=0.041)。多因素分析進(jìn)一步表明，TIMD4高表達(dá)是CRC患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(HR：2.813，95% CI：1.013～7.811，P=0.047)。見(jiàn)表2。

表1 TIMD4表達(dá)與CRC患者臨床病理特征關(guān)系

A為組織芯片染色圖像；B為CRC中TIMD4蛋白表達(dá)高于正常組織(P<0.01)；C為T(mén)IMD4在CRC中高表達(dá)(免疫組化染色，×100，×400)；D為T(mén)IMD4在CRC中低表達(dá)(免疫組化染色，×100，×400)；E為T(mén)IMD4在正常組織中低表達(dá)(免疫組化染色，×100，×400)。

圖2 TIMD4高低表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者生存的影響

表2 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析TIMD4在CRC中的預(yù)后價(jià)值

3 討論

目前，結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率較高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，雖然對(duì)其治療方法及策略已有極大改善，但預(yù)后不良仍然成為亟待解決的臨床問(wèn)題[11]。機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)主要通過(guò)識(shí)別腫瘤細(xì)胞，將腫瘤抗原呈遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞以及對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性殺傷[12-13]。在此過(guò)程中，激活T細(xì)胞需要協(xié)同刺激信號(hào)的協(xié)助，這些刺激信號(hào)需要“免疫檢查點(diǎn)”進(jìn)行調(diào)控。目前關(guān)于免疫檢查點(diǎn)關(guān)注較多的有TIM家族和PD-1等，此類(lèi)分子在腫瘤微環(huán)境免疫調(diào)節(jié)中起到至關(guān)重要的作用[14]。

TIM-4是TIM家族的一員，主要作為磷脂酰絲氨酸受體，促進(jìn)凋亡細(xì)胞的吞噬[15-16]。研究表明，TIM-4能抑制TIM-4缺陷小鼠的炎癥反應(yīng)并維持免疫耐受，這意味著TIM-4可能在腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮潛在作用[17]。在B16黑色素瘤小鼠模型的實(shí)驗(yàn)中，TIMD4單克隆抗體能夠增強(qiáng)其抗癌反應(yīng)，且TIMD4和TIM3單克隆抗體聯(lián)合使用可以進(jìn)一步提高疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤活性[18]。在胃癌的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，阻斷TIMD4和TIM1的相互作用能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)[19]。但TIMD4在CRC中的表達(dá)和作用尚缺乏深入研究。因此，本研究首先通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)TIMD4mRNA高表達(dá)與較深CRC侵犯層次相關(guān)。有研究報(bào)道，非小細(xì)胞肺癌患者中TIMD4的高表達(dá)與臨床預(yù)后不良顯著相關(guān)[20]。Yano等[21]發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞惡性腫瘤中高表達(dá)TIMD4提示臨床預(yù)后不良。本研究進(jìn)一步分析TIMD4與結(jié)直腸癌患者臨床病理資料之間的關(guān)系，證明CRC中TIMD4蛋白表達(dá)高于正常組織，TIMD4蛋白高表達(dá)與低病理分級(jí)、高臨床分期、深侵犯層次、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，此結(jié)果與Tan等[22]相關(guān)研究結(jié)果相似?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，推測(cè)TIMD4在腫瘤組織中高表達(dá)對(duì)患者預(yù)后具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，采用Kaplan-Meier生存分析法比較腫瘤組織中TIMD4表達(dá)與患者生存情況，研究結(jié)果顯示，TIMD4高表達(dá)的CRC患者術(shù)后總生存時(shí)間較TIMD4低表達(dá)者短，兩者生存情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TIMD4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，可能由于TIMD4高表達(dá)引起機(jī)體T細(xì)胞功能障礙，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸作用。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌中TIMD4高表達(dá)可作為CRC患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。

綜上所述，TIMD4在CRC組織中表達(dá)增加，且與患者組織學(xué)分型、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且CRC中TIMD4高表達(dá)患者提示臨床預(yù)后不良。因此，TIMD4有望成為結(jié)直腸癌免疫治療靶向調(diào)控的一個(gè)重要靶點(diǎn)，也有望成為結(jié)直腸癌早期分子診斷與預(yù)后評(píng)估的重要分子。