?規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)沼液中原核微生物的分離與鑒定?

?鄒坤 楊佳玨 趙彩宏 謝倫宏 賀愛蘭

摘 要：為充分利用規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的沼液資源，防止農(nóng)業(yè)面源污染，采集了婁底市周邊的4個(gè)豬場(chǎng)發(fā)酵罐出口和曝氣池出口處的沼液進(jìn)行原核微生物的分離與鑒定，并對(duì)從中分離純化出的大腸桿菌K-12、大腸桿菌IAI和枯草芽孢桿菌 PS832進(jìn)行了理化性質(zhì)和相關(guān)抗性研究。結(jié)果表明：大腸桿菌K-12對(duì)氨芐青霉素和卡那霉素具有一定的抗性;大腸桿菌IAI對(duì)氨芐青霉素和鏈霉素不敏感，但對(duì)慶大霉素和卡那霉素敏感;枯草芽孢桿菌 PS832對(duì)氨芐霉素、卡那霉素和慶大霉素敏感，對(duì)鏈霉素不敏感。此外，研究顯示用200 W超聲波間斷性處理這3類菌株20～30次（工作10 s、間歇10 s為1次）可以達(dá)到理想滅菌效果。

關(guān)鍵詞：規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng);沼液;原核微生物;理化分析

中圖分類號(hào)：S828; X713文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2020）10-0067-05

Abstract： Biogas slurry is rich in nitrogen， phosphorus， potassium and other physiological active substances， but harmless treatment is difficult. How to use it as resources is an important content of agricultural non-point source pollution control. In this paper， the biogas?slurry at the outlets of fermentation tanks and aeration tanks of four pig farms around Loudi City was sampled. Escherichia coli K-12，?Escherichia coli IAI and Bacillus subtilis PS832 were obtained from biogas slurry through isolation and purification， and their physicochemical properties and related resistances were determined. The results show that Escherichia coli K-12 is resistant to ampicillin and kanamycin; Escherichia coli IAI is not sensitive to ampicillin and streptomycin， but sensitive to gentamicin and kanamycin; Bacillus subtilis PS832 is sensitive to ampicillin， kanamycin and gentamicin， but not sensitive to streptomycin. The ideal sterilization for the 3 types of bacteria could be achieved by periodic treatment with 200 W ultrasonic waves for 20-30 times （each time run for 10s with a 10s interval）.

Key words： large-scale pig farms; biogas slurry; prokaryotic microorganism; physicochemical analysis

沼氣發(fā)酵技術(shù)在我國應(yīng)用歷史長(zhǎng)久，在各級(jí)政府政策和財(cái)政的支持下，各類沼氣工程連續(xù)幾年迅猛發(fā)展，帶來了大量的生物能源，減少了農(nóng)用廢棄物，增加了經(jīng)濟(jì)效益，但與此同時(shí)，沼氣工程在產(chǎn)生沼氣的同時(shí)，大量的沼液隨之產(chǎn)生，如何合理利用使之變廢為寶，成為急待解決的另一個(gè)課題[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，沼液中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及微量元素，沼液的主要利用方式則包括直接歸田或與其他肥料配合歸田[2]、沼液浸種[3]、葉面肥[4]、飼料添加劑等。與沼渣相比，沼液的養(yǎng)分含量較低，且不易運(yùn)輸，儲(chǔ)藏，具有二次產(chǎn)氣等特點(diǎn)，無害化處理難度較大， 因此，有必要了解不同地區(qū)以及以不同底物發(fā)酵的沼液的理化性質(zhì)及特性，為其合理利用提供理論依據(jù)。此外，沼液中含有種類豐富，數(shù)量巨大的微生物，并被證實(shí)具有增產(chǎn)和改善農(nóng)作物品質(zhì)的作用，具有生物肥料和生物農(nóng)藥的雙重功效[5-7]。近年來相關(guān)學(xué)者進(jìn)行了沼液中微生物的分離，從沼液中分離出一株酵母菌，并對(duì)其分類地位進(jìn)行了研究[8]。很多學(xué)者研究了沼液對(duì)草莓土傳病害的防治效果，并從中分離了拮抗細(xì)菌[9]。還有學(xué)者對(duì)不同季節(jié)的沼液中細(xì)菌的形態(tài)與含量進(jìn)行了研究[10]。筆者對(duì)從沼液中分離純化出的大腸桿菌K-12、大腸桿菌IAA和枯草芽孢桿菌 PS832進(jìn)行理化性質(zhì)和相關(guān)抗性研究，旨在為沼液的運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試樣本 沼液樣本采集于婁底市新化、雙峰等地區(qū)的4個(gè)生豬規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)，采集點(diǎn)為發(fā)酵罐出口和曝氣池出口處。

1.1.2 試劑和儀器設(shè)備 實(shí)驗(yàn)室主要試劑為氯化鈉（NaCl）、氨芐霉素（AMP）、卡那霉素（Kana）、慶大霉素（Genta）、鏈霉素（Strept）、草酸銨（A.oxa）等，其他試劑：酵母浸出液體、無水乙醇、胰蛋白胨、瓊脂粉、蒸餾水、甘油、無菌水、結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、蕃紅染液。儀器設(shè)備：EP管、燒杯、錐形瓶、培養(yǎng)箱、冰箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本前處理 采集的沼液樣本存放于2 mL EP管中，每個(gè)點(diǎn)取樣為3管，共6 mL，做好標(biāo)記。

1.2.2 培養(yǎng)液和培養(yǎng)基的配置 培養(yǎng)液和培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，配方：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，蒸餾水1 L，瓊脂15～20 g /L （用于培養(yǎng)基）。配制流程如下：稱取胰蛋白胨4 g、酵母提取物2 g、氯化鈉4 g，放入500 mL燒杯中;加入400 mL蒸餾水用玻璃棒攪拌均勻直至溶解;分別倒入2個(gè)250 mL的錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶200 mL溶液;分別稱取瓊脂粉2份，每份4 g，然后分別加入2個(gè)錐形瓶中，用棉塞將錐形瓶口塞嚴(yán)后用報(bào)紙包裹瓶口，并用細(xì)繩幫助固定報(bào)紙。

1.2.3 涂板培養(yǎng) 將豬場(chǎng)采集的沼液樣本進(jìn)行涂板培養(yǎng)，分別取200 μL樣本涂布到配制好的LB培養(yǎng)板上，具體操作如下：（1）將涂布器放在火焰上灼燒滅菌，在火焰旁冷卻涂布器;（2）打開盛有原沼液的EP管，將試管口通過火焰;用200 μL移液器吸取200 μL標(biāo)號(hào)為1-1的原沼液緩慢打入LB培養(yǎng)板中，將已冷卻的涂布器將原液涂布均勻，將試管口過火焰，并塞上棉塞，灼燒涂布器，待其冷卻;（3）重復(fù)以上操作，分別涂布好樣本;（4）將平板倒置，放入37℃培養(yǎng)箱中培育24～48 h后查看其菌落生長(zhǎng)狀況并拍照記錄。

1.2.4 單菌落培養(yǎng) 用接種環(huán)挑取遠(yuǎn)離群菌落的單菌落劃線培養(yǎng)。

1.2.5 革蘭氏染色 將分離純化出的無污染的單菌落挑出，進(jìn)行革蘭氏染色。革蘭氏染色法[10]。

1.2.6 菌種保存 （1）將要保存菌種接種于LB液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（肉眼可見培養(yǎng)液渾濁即可）。（2）將300 μL甘油裝于1 mL離心管中并和槍頭等試驗(yàn)用品用高壓滅菌鍋于121℃滅菌30 min。（3）無菌條件下將菌液700 μL混合于裝有甘油的離心管中，于-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.7 菌種鑒定 將甘油保存好的菌種的其中一份快遞寄到上海生工進(jìn)行16sRNA測(cè)序。登陸NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇100%匹配的結(jié)果為菌種的種名。

1.2.8 抗性試驗(yàn) 確定菌種后使用常見的抗生素（氨芐、卡納、慶大霉素、鏈霉素）對(duì)其進(jìn)行處理，試驗(yàn)前準(zhǔn)備好1 000、200 、100 μL槍頭，用槍頭盒裝好以及用報(bào)紙包裹好后滅菌。培養(yǎng)基配置倒板前加入抗生素液體（氨芐、卡納、慶大霉素、鏈霉素），搖勻后倒板。做好抗生素板后，接種單菌落進(jìn)行恒溫箱37℃過夜培養(yǎng)，觀察是否有菌落長(zhǎng)出。

1.2.9 超聲波實(shí)驗(yàn) 挑取單菌落進(jìn)行小管擴(kuò)大培養(yǎng)，5 h后觀察培養(yǎng)液是否變渾濁，然后進(jìn)行OD600的濃度測(cè)量，稀釋10倍后，將裝有菌液的5 mL EP管放入細(xì)胞超聲波破碎機(jī)（置于冰上破碎）。同時(shí)，取原菌液200 μL進(jìn)行涂板，標(biāo)記為1號(hào)板。設(shè)置功率為200 W，間斷性地超聲（工作10 s，間歇10 s）。第一次超聲波次數(shù)為10次，然后吸取200 μL進(jìn)行涂板，標(biāo)記為2號(hào)板。輕輕搖勻后繼續(xù)超聲10次，吸取200 μL進(jìn)行涂板，標(biāo)記為3號(hào)板，依次進(jìn)行上述超聲和涂板，超聲波次數(shù)分別為0、10、20、30次。涂板培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼液涂板

4個(gè)豬場(chǎng)分別編號(hào)為1、2、3、4號(hào)豬場(chǎng)，在每個(gè)點(diǎn)取樣中各取200 μL沼液樣本涂板，菌落長(zhǎng)勢(shì)情況如圖1、圖2。

2.2 菌落形態(tài)觀察

2.2.1 未知菌落1 挑取單菌落在37℃下培養(yǎng)18 h后形成的單菌落直徑約1.5 mm左右。菌落呈現(xiàn)灰白、半透明，小凸起，邊緣整齊光滑，在LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)有特殊氣味產(chǎn)生。菌落形態(tài)見圖3A。

2.2.2 未知菌落2 挑取單菌落在37℃下培養(yǎng)18 h后形成的菌落，菌落形態(tài)為白色，圓形，表面光滑，半透明，邊緣潮濕。培養(yǎng)結(jié)果見圖3B。

2.2.3 未知菌落3 挑取單菌落在37℃下培養(yǎng)18 h形成菌落，菌落較大，表面呈白色，表面典型的粗糙不規(guī)則，有較多隆起和褶皺，膨大化，邊緣不透明。培養(yǎng)結(jié)果見圖3C。

2.3 革蘭氏染色

對(duì)未知菌落1的革蘭氏染色后，呈現(xiàn)出紅色，鑒定為革蘭氏陰性菌（見圖4A）;對(duì)未知菌落2的革蘭氏染色后，呈現(xiàn)出紅色，鑒定為革蘭氏陰性菌（見圖4B）;對(duì)未知菌落3的革蘭氏染色后，呈現(xiàn)出紫色，鑒定為革蘭氏陽性菌（見圖4C）。

2.4 測(cè)序鑒定

將菌液樣本送到上海生工測(cè)序，將序列通過BLAST比對(duì)，在基因庫中找出匹配率最高的物種，結(jié)果未知菌落1、2、3分別為大腸桿菌K-12、大腸桿菌IAI、枯草芽孢桿菌PS832。

2.5 抗性分析

2.5.1 大腸桿菌K-12 將大腸桿菌K-12分別接種于氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素的抗生素板上，結(jié)果表明K-12對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素有一定的抗性，對(duì)鏈霉素和慶大霉素較為敏感（見圖5）。

2.5.2 大腸桿菌IAI 將大腸桿菌IAI分別接種于氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素的抗生素板上，結(jié)果表明IAI對(duì)氨芐青霉素和鏈霉素不敏感，但對(duì)慶大霉素和卡那霉素敏感（見圖6）。

2.5.3 枯草芽孢桿菌PS832 將枯草芽孢桿菌PS832分別接種于氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素的抗生素板上，結(jié)果表明草芽孢桿菌 PS832對(duì)氨芐霉素，卡那霉素和慶大霉素敏感，對(duì)鏈霉素不敏感（見圖7）。

2.6 超聲波處理

超聲波處理結(jié)果（圖8-10）表明，以功率200 W超聲波破碎機(jī)超聲破碎10次能殺滅部分細(xì)菌，20次、30次超聲波處理可以達(dá)到理想滅菌效果。

3 結(jié) 論

3.1 大腸桿菌IAI

經(jīng)過鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌IAI對(duì)慶大霉素和卡那霉素極為敏感，超聲波也能影響大腸桿菌IAI的生長(zhǎng)，此次研究發(fā)現(xiàn)，在沼液中加入慶大霉素、鏈霉素兩種抗生素能夠抑制部分菌的生長(zhǎng)，但是長(zhǎng)期使用抗生素容易使菌變異產(chǎn)生抗藥性，而且經(jīng)濟(jì)成本太高，若將發(fā)酵后的沼液經(jīng)過功率為200 W，且大于30次超聲波處理，就能夠?qū)⑵渲械牟糠旨?xì)菌殺死，就能將沼液循環(huán)利用。

3.2 大腸桿菌K-12

經(jīng)過鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌K-12對(duì)氨芐青霉素和卡那霉素兩種抗生素具有一定的抗性，但慶大霉素、鏈霉素兩種抗生素能夠抑制大腸桿菌k-12生長(zhǎng)，但是長(zhǎng)期使用抗生素容易使菌變異產(chǎn)生抗藥性，若利用功率為200 W，且大于30次超聲波處理，就能夠?qū)⒋蟛糠旨?xì)菌殺死，就能將沼液循環(huán)利用。

3.3 枯草芽孢桿菌PS832

經(jīng)過鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌PS832對(duì)氨芐青霉素、慶大霉素和卡那霉素都極其敏感，所以對(duì)其的處理也是較為容易的。鏈霉素對(duì)大部分的革蘭氏陽性菌都存在抑制作用[9]，可是在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)無影響?？莶菅挎邨U菌PS832對(duì)鏈霉素不敏感的原因可能是實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)長(zhǎng)期使用鏈霉素作為生豬的治療藥劑，導(dǎo)致其產(chǎn)生抗藥性，當(dāng)然也可能是出現(xiàn)了噬菌體污染的情況，不過還需要進(jìn)一步驗(yàn)證[11]，當(dāng)然超聲處理也能起到殺滅枯草芽孢桿菌PS832的作用。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）