孵化期LED綠光照射對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期肌纖維發(fā)育的影響

郝文文，張 貝，任一帆，孟 婕，鞏 靜，楊 晴，耿立英，張傳生，李祥龍

(河北科技師范學(xué)院河北省特色動(dòng)物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066600)

禽類是光敏性動(dòng)物，具有特殊的光受體通路[1]。孵化期間對(duì)禽類種蛋進(jìn)行光照調(diào)控可促進(jìn)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育、提高免疫力及促進(jìn)孵化后生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率及抗壓抗應(yīng)激能力[2]。因此，科學(xué)合理地利用光色信息對(duì)于改善禽蛋孵化性能、提高家禽生產(chǎn)性能具有重要意義。

研究表明，光譜對(duì)禽類胚胎發(fā)育的影響存在區(qū)別，其中單色綠光對(duì)禽類胚胎發(fā)育和肌肉生長(zhǎng)的促進(jìn)作用顯著優(yōu)于其他光色[3]。肉雞胚胎期給予單色綠光照射能增強(qiáng)代謝，促進(jìn)雞胚骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化，顯著增加胚胎后期至出雛后的體質(zhì)量和胸肌比例，提高出雛率和健雛率[4，5]。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，單色綠光能促進(jìn)雞胚褪黑激素分泌、肝臟的發(fā)育和IGF-1分泌[4,6]，顯著提高胚胎后期及生長(zhǎng)期肉仔雞血清GH和IGF-1含量[3,7]，通過MyoD調(diào)控途徑促進(jìn)胚胎骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)胚胎肌肉顯著發(fā)育[3]。然而，因受遺傳、發(fā)育等因素影響，禽類蛋殼的物理化學(xué)特性不同，胚胎能接收到綠光的照度也不同。因此，對(duì)于不同品種種蛋的最優(yōu)光照條件均有待研究。本次試驗(yàn)以壩上長(zhǎng)尾雞為研究對(duì)象，探索不同照度的單色綠光照射對(duì)胚胎期肌肉發(fā)育的影響，為壩上長(zhǎng)尾種蛋孵化科學(xué)合理利用人工光照提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及孵化條件

本次研究中使用的壩上長(zhǎng)尾雞種蛋引自張家口市綠色田園禽業(yè)科技有限公司，160枚種蛋質(zhì)量為(52.25±3)g，種蛋進(jìn)行消毒、編號(hào)、稱質(zhì)量(入孵蛋質(zhì)量)，孵化器(NLF-320型微電腦全自動(dòng)孵化器，山東農(nóng)科孵化設(shè)備有限公司，山東德州)規(guī)格為長(zhǎng)110 cm×寬100 cm×高90 cm。每個(gè)孵化器至少提前3個(gè)工作日進(jìn)行運(yùn)行，孵化箱用溫度計(jì)和濕度計(jì)進(jìn)行實(shí)時(shí)校準(zhǔn)和監(jiān)測(cè)。孵化條件：1～6 d孵化溫度為38.0 ℃，濕度為60%；7～18 d孵化溫度為37.8 ℃，濕度為55%；孵化后期溫度為37.2 ℃，濕度為65%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

設(shè)置3個(gè)不同照度LED綠光對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞種蛋進(jìn)行照射，在種蛋孵化的10～18 d給予連續(xù)光照(12 h光照-12 h黑暗)。光照度分別為弱光組30～80 lx，中光組90～140 lx，強(qiáng)光組150～200 lx；對(duì)照組保持黑暗。在12，14，16，18，20胚齡時(shí)每組收集3個(gè)種蛋，剝殼后取雞胚的胸肌和腿肌(腓腸肌)用1.44 mol/L的甲醛溶液進(jìn)行固定24 h，制作石蠟切片。

1.3 主要試劑及儀器

試劑分別為：1.44 mol/L的甲醛溶液(購(gòu)自石家莊豐悅科技有限公司)，二甲苯(購(gòu)自泰安正大化工有限公司)，石蠟(購(gòu)自克拉瑪爾)，蘇木素染液(購(gòu)自石家莊豐悅科技有限公司)，伊紅染液(購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)，鹽酸、中性膠(購(gòu)自石家莊豐悅科技有限公司)，各級(jí)乙醇(國(guó)產(chǎn)分析純)。

儀器主要有：微電腦全自動(dòng)孵化控制器(NLF-320型，山東農(nóng)科孵化設(shè)備有限公司)、系統(tǒng)生物顯微鏡(OLYMPUS-BX40，奧林巴斯(中國(guó))公司)。

1.4 石蠟切片的制作

取雞胚的胸肌和腿肌，剪取小量肌肉塊后快速用1.44 mol/L的甲醛溶液進(jìn)行固定，24 h之后取出組織塊，裝入包埋盒；乙醇處理，室溫脫水，室溫下浸入二甲苯，脫色。在60 ℃石蠟下浸漬4 h后，進(jìn)行包埋，冷卻，對(duì)其完全脫水。每個(gè)組織塊做3張連續(xù)組織切片。

1.5 切片HE染色

60 ℃烘片1 h，二甲苯脫蠟；蘇木素染色2 min，水洗，分化液(鹽酸酒精)分化，返藍(lán)液(氨水)進(jìn)行返藍(lán)；伊紅染色1 min，水洗；依次過不同濃度乙醇，至二甲苯(1)，二甲苯(2)(各5 min)；膠封片，常溫保存。

1.6 測(cè)定與統(tǒng)計(jì)

將染色后的切片用顯微鏡進(jìn)行拍照，用Olympus顯微系統(tǒng)進(jìn)行觀察，每個(gè)時(shí)期選取3個(gè)胸肌或腿肌樣品的切片，每張切片選取3個(gè)不同的視野，每個(gè)視野選取至少20條肌纖維，分別測(cè)量每條肌纖維平均直徑(μm)和橫截面的面積(μm2)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行多重顯著性差異，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 孵化期不同照度綠光照射雞胚胎期腿肌發(fā)育的形態(tài)學(xué)比較

雞胚12～18胚齡是成肌細(xì)胞增殖分化成肌管的重要時(shí)期。對(duì)不同照度LED綠光照射孵化下的壩上長(zhǎng)尾雞腿肌進(jìn)行切片和染色，結(jié)果表明，弱光組的壩上長(zhǎng)尾雞的腿肌，在12胚齡肌纖維的輪廓比較完整，但還不是特別的清晰，此時(shí)肌肉發(fā)展處于成肌細(xì)胞增殖和分化的混合時(shí)期(圖1)。14胚齡時(shí)腿肌肌纖維較??；當(dāng)胚胎16胚齡時(shí)，肌纖維直徑逐漸變大，輪廓清晰，肌束內(nèi)游離的肌纖維逐漸變少，肌細(xì)胞融合時(shí)間逐漸減少，肌纖維數(shù)量基本固定；18胚齡時(shí)肌纖維已經(jīng)基本成熟，未見有明顯的未融合細(xì)胞，此時(shí)肌纖維數(shù)量也已基本確定；20胚齡時(shí)肌纖維粗細(xì)略有增加。

中光組的壩上長(zhǎng)尾雞腿肌，12胚齡時(shí)肌纖維輪廓不清晰，肌細(xì)胞融合不完全。14胚齡時(shí)開始呈現(xiàn)出較清晰的肌纖維輪廓，但仍有許多未融合的肌細(xì)胞游離于肌纖維外；到16胚齡時(shí)，未融合的細(xì)胞大量減少，肌細(xì)胞數(shù)量逐漸固定；18胚齡時(shí)，肌纖維基本成熟，肌纖維數(shù)量相對(duì)固定；20胚齡時(shí)肌纖維直徑增加。

強(qiáng)光組的壩上長(zhǎng)尾雞腿肌，在12胚齡時(shí)肌肉發(fā)育未完全，仍處于肌細(xì)胞增殖和分化的混合期，肌細(xì)胞融合程度較低；14胚齡時(shí)肌細(xì)胞輪廓逐漸清晰；16胚齡時(shí)肌纖維輪廓更加清晰，肌肉基本完成增殖和分化階段，未融合的細(xì)胞明顯減少，肌纖維直徑不斷增大；到18胚齡時(shí)肌纖維基本成熟，未有明顯未融合細(xì)胞，此時(shí)肌纖維數(shù)量基本確定。20胚齡，肌纖維直徑增加緩慢。

黑暗組的壩上長(zhǎng)尾雞腿肌，在12胚齡時(shí)肌細(xì)胞融合不完全；14胚齡時(shí)肌纖維的輪廓開始呈現(xiàn)，但仍有少量肌細(xì)胞未融合。16胚齡時(shí)，未融合的肌細(xì)胞大量減少，肌纖維數(shù)量增加。到18胚齡時(shí)，肌纖維發(fā)育基本成熟。20胚齡時(shí)，肌纖維數(shù)目逐漸固定。

孵化期使用不同照度LED綠光照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：16胚齡時(shí)，壩上長(zhǎng)尾雞腿肌肌纖維直徑，強(qiáng)光組顯著低于弱光組、中光組和黑暗組(P<0.05)(表1)。18胚齡時(shí)，弱光光照組和中光組壩上長(zhǎng)尾雞腿肌肌纖維直徑顯著大于強(qiáng)光組和黑暗組(P<0.05)。在20胚齡時(shí)，中光組壩上長(zhǎng)尾雞腿肌肌纖維直徑最大，顯著大于弱光組、強(qiáng)光組(P<0.05)；而弱光組腿部肌纖維直徑略大于強(qiáng)光組，但差異不顯著(P>0.05)；黑暗組的腿肌肌纖維直徑最小，顯著低于光照組(P<0.05)。

圖1 不同照度LED綠光孵化下壩上長(zhǎng)尾雞胚胎腿肌橫截面

表1 孵化期不同照度LED綠光對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞腿肌肌纖維直徑和橫截面積的影響

2.2 孵化期不同照度綠光照射雞胚胎期胸肌發(fā)育的形態(tài)學(xué)比較

不同照度LED綠光照射壩上長(zhǎng)尾雞胚胎胸肌肌纖維發(fā)育情況見圖2。由于腿肌和胸肌在發(fā)育過程中所受到的調(diào)控通路不同，細(xì)胞分層和遷徙的具體時(shí)期也不一致，因此后期的肌纖維形成也肯定存在差異。通過對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞各胚齡胸肌進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)弱光組的壩上長(zhǎng)尾雞的胸肌，在12胚齡時(shí)肌纖維的輪廓比較模糊。14胚齡時(shí)腿肌肌纖維較??；隨著胚齡的增長(zhǎng)，16胚齡時(shí)肌纖維直徑逐漸變大，游離的肌纖維逐漸變少，肌細(xì)胞融合時(shí)間逐漸減少，肌纖維數(shù)量基本固定；18胚齡時(shí)肌纖維已經(jīng)基本成熟，未見有明顯的未融合細(xì)胞，此時(shí)肌纖維數(shù)量也已基本確定；20胚齡時(shí)肌纖維粗細(xì)略有增加。

圖2 不同照度LED綠光孵化下壩上長(zhǎng)尾雞胚胎胸肌橫截面

中光組的壩上長(zhǎng)尾雞胸肌，在12胚齡肌纖維輪廓尚不清晰；14胚齡時(shí)開始呈現(xiàn)出較清晰的肌纖維輪廓，但仍有許多未融合的肌細(xì)胞游離于肌纖維外；到16胚齡時(shí)肌纖維輪廓比較清晰，未融合的細(xì)胞大量減少，肌細(xì)胞數(shù)量逐漸固定；18胚齡時(shí)肌纖維數(shù)量基本固定；20胚齡胚齡時(shí)肌纖維直徑增加。

強(qiáng)光組的壩上長(zhǎng)尾雞腿肌，在12胚齡時(shí)肌肉發(fā)育未完全，仍處于肌細(xì)胞增殖和分化的混合期，肌細(xì)胞融合程度較低；14胚齡時(shí)肌細(xì)胞輪廓逐漸清晰；16胚齡時(shí)肌纖維輪廓更加清晰，肌肉基本已完成增殖和分化階段，未融合的細(xì)胞明顯減少，肌纖維直徑不斷增大；到18胚齡時(shí)肌纖維基本成熟，未見有明顯未融合細(xì)胞，此時(shí)肌纖維數(shù)量基本確定。

黑暗組的壩上長(zhǎng)尾雞腿肌，在12胚齡時(shí)肌細(xì)胞融合不完全；14胚齡時(shí)肌纖維的輪廓開始呈現(xiàn)，但仍有少量肌細(xì)胞未融合；16胚齡時(shí)，未融合的肌細(xì)胞大量減少，肌纖維數(shù)量增加；到18胚齡時(shí)肌纖維基本成熟；20胚齡時(shí)肌纖維數(shù)目逐漸固定。

比較不同照度LED綠光照射壩上長(zhǎng)尾雞胸肌肌纖維直徑和橫截面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：18胚齡時(shí)，黑暗組壩上長(zhǎng)尾雞胸肌肌纖維直徑最大，顯著大于光照組(P<0.05)(表2)；在20胚齡時(shí)，中光組壩上長(zhǎng)尾雞胸肌肌纖維直徑最大，顯著大于弱光組(P<0.05)，黑暗組壩上長(zhǎng)尾雞胸肌肌纖維顯著小于中光組和弱光組(P<0.05)。

表2 孵化期不同照度LED綠光對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胸肌肌纖維直徑和橫截面積的影響

壩上長(zhǎng)尾雞胸肌肌纖維橫截面積在18胚齡時(shí)中光組最大，顯著大于黑暗組(P<0.05)；弱光組胸肌橫截面積略大于黑暗組，但差異不顯著(P>0.05)；強(qiáng)光組胸肌橫截面積顯著小于黑暗組(P<0.05)。20胚齡時(shí)，中光組、弱光組壩上長(zhǎng)尾雞胸肌肌纖維橫截面積顯著大于黑暗組(P<0.05)，而強(qiáng)光組的胸肌橫截面積顯著低于黑暗組(P<0.05)。

3 討 論

產(chǎn)肉性能是家禽生產(chǎn)主要的經(jīng)濟(jì)性狀，肌纖維在胚胎期發(fā)育的速度與其出生后肌肉生長(zhǎng)呈正相關(guān)。禽類的胚胎期是成肌細(xì)胞增生和肌纖維形成的關(guān)鍵時(shí)期[8]，在胚胎期肌纖維數(shù)量基本固定，出生后肌纖維數(shù)量基本不變，出雛后肌肉系統(tǒng)發(fā)育主要有兩方面：一是肌纖維長(zhǎng)度逐漸增長(zhǎng)，二是肌纖維橫截面積變大[9]。本次研究利用不同照度LED綠光燈對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期進(jìn)行照射，表明適宜LED綠光照度對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期的肌纖維發(fā)育有促進(jìn)作用，與以前的調(diào)查結(jié)果一致[10]。雞胚的腿肌和胸肌是由體節(jié)發(fā)育而來(lái)的軸下肌節(jié)是形成軀干和四肢肌肉的來(lái)源[11]，雖然都是來(lái)源于單一的體節(jié)，腿肌和胸肌的發(fā)育卻依賴于不同的生肌程序和發(fā)育通路。這些發(fā)育通路具有不同特點(diǎn)，導(dǎo)致腿肌和胸肌在胚胎期發(fā)育不一致[12]，雞的胸肌肌原細(xì)胞在4胚齡才開始發(fā)育，而腿肌肌原細(xì)胞在2.5胚齡就已開始發(fā)育[13]。

禽類的眼睛和下丘腦是光的感受器，在孵化期光感受器收到光信號(hào)刺激，分泌褪黑激素增加，從而使生長(zhǎng)激素釋放激素分泌增加，生長(zhǎng)素含量增加，導(dǎo)致肝臟分泌IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子)增加，促進(jìn)生長(zhǎng)軸基因表達(dá)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分裂增加，促進(jìn)肌纖維發(fā)育。有研究報(bào)道：在雞的生長(zhǎng)前期，綠光是通過刺激衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)肌原細(xì)胞的數(shù)量增加。本次研究中，20胚齡時(shí)綠光照射孵化下雞胚腿肌肌纖維面積和腿肌肌纖維直徑均顯著大于黑暗組，而中光組(90～140 lx)最顯著，這與張林等[14]在肉仔雞孵化給予單色光間歇性刺激的研究結(jié)果一致。研究還發(fā)現(xiàn)，禽類腿部肌肉發(fā)育快于胸部肌肉，腿肌纖維發(fā)育不僅在融合形成上比胸肌快，而且在后期肌纖維肥大過程中也快于胸肌纖維。由研究結(jié)果推測(cè)，雞胚發(fā)育末期，不同照度LED綠光照射對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞肌肉發(fā)育存在差異，而這種差異可能是LED綠光燈照影響到肌肉發(fā)育的調(diào)控通路上。

4 結(jié) 論

壩上長(zhǎng)尾雞種蛋在孵化期間給予適當(dāng)?shù)腖ED綠光照射，可以促進(jìn)雞胚胎期肌纖維發(fā)育。其中，使用90～140 lx的LED綠光照射時(shí)壩上長(zhǎng)尾雞腿肌肌纖維和胸肌肌纖維發(fā)育效果最佳，而孵化期使用150～200 lx的LED綠光照射時(shí)，對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期胸肌肌纖維的發(fā)育有一定程度的抑制作用。