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    循環(huán)腫瘤細(xì)胞在胃癌臨床分期判斷、療效監(jiān)測及預(yù)后評估中的價值

    2020-12-21 08:12:14劉霞董麗娟張軍鵬賀繼東薛海蘭王順
    海南醫(yī)學(xué) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:分型外周血陰性

    劉霞,董麗娟,張軍鵬,賀繼東,薛海蘭,王順

    寶雞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科1、檢驗科2,陜西 寶雞 721000

    胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一,據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2012年全球胃癌新發(fā)病例約95.1萬例,死亡病例約72.3萬例,其發(fā)病率和死亡率分別居全球惡性腫瘤的第四位和第三位,多發(fā)生在發(fā)展中國家[1-2]。據(jù)2012年我國腫瘤登記中心數(shù)據(jù)顯示,胃癌新發(fā)病例約42.4 萬例,死亡病例約29.8 萬例,約占全世界的50%,疾病負(fù)擔(dān)重[3]。大多數(shù)胃癌患者確診時已處于中晚期,失去最佳治療時機(jī)及方案,預(yù)后較差[4]。此外,轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)亦是影響胃癌預(yù)后的重要原因,血行轉(zhuǎn)移是其主要方式,與循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)相關(guān),外周血中CTCs數(shù)量稀少,對檢測方法有較高的要求,研究受限[5-6]。近年,隨著檢測技術(shù)不斷完善,CTCs檢出率明顯升高,其作為一種新型非侵入性診斷工具,在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤早期診斷、療效評估及預(yù)后預(yù)測中展現(xiàn)出巨大的價值[7-8]。本研究旨在探討外周血CTCs在胃癌臨床分期判斷、療效監(jiān)測及預(yù)后評估中的價值。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選取 2015 年 6 月至 2017 年 6 月于寶雞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科診治的130 例胃癌患者(胃癌組)納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前胃鏡取活檢病理確診為胃癌者;②入組前未給予任何抗腫瘤治療者;③均行胃癌根治性手術(shù)者;④治療依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn):①孕期或哺乳期患者;②存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者;③合并其他任何惡性腫瘤者;④合并肝腎功能及凝血功能障礙者。胃癌組患者中男性90 例,女性40例;年齡22~80 歲,平均(49.24±10.46)歲;按美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第 7 版 TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[9],其中Ⅰ期 23 例,Ⅱ期39 例,Ⅲ期 68 例;T1~2期 51 例,T3~4期 51 例 79 例;N0期40 例,N1~3期 90 例。選取同期 40 例健康體檢者作為對照組,其中男性 27 例,女性 13 例;年齡25~78 歲,平均(50.11±10.92)歲。兩組受檢者的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究已通過本院倫理委員會批準(zhǔn)[批件號:2020 倫委會字第(001)號],所有受檢者自愿參加本研究,且簽署知情同意書。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)本采集 采用EDTA抗凝采血管收集健康對照組和胃癌組(入組后第1 天和術(shù)后第3 天)外周血5 mL,顛倒混勻10 次(抗凝血),若不能及時進(jìn)行后續(xù)實驗,須在2℃~8℃保存。

    1.2.2 外周血CTCs 富集[8]采用CanPatrolTMCTC-二代捕獲技術(shù)完成外周血CTCs富集,具體操作如下:第一,加紅細(xì)胞裂解液,混勻,室溫靜置30 min,1 850 r/min 離心10 min,去上清;第二,加固定劑混勻靜止8 min,后將其與納米濾膜過濾器和真空泵連接,制備得到細(xì)胞濾膜,實現(xiàn)CTCs納米技術(shù)截留及富集,最后用甲醛固定60 min。

    1.2.3 RNA 多重原位雜交分析(RNA in situ hybridisation,RNA-ISH)[10]固定后,將細(xì)胞濾膜依次進(jìn)行親水-透化-消化-探針雜交-預(yù)擴(kuò)增-擴(kuò)增-顯色7個步驟,后在樣本上加抗淬滅劑(含DAPI),放置5 min后在自動識別系統(tǒng)上完成熒光信號識別(CTCs 類型不同,熒光信號不同),其儀器為FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀(購自美國BD 公司)。其中上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)基因探針包括EpCAM、CK8、CK18、CK19、Vimentin、Twist 和 CD45。參考RNAscope Multiplex Assay Kit 試劑盒(購自美國Thermo Fisher公司)說明書進(jìn)行判斷,CTCs判斷標(biāo)準(zhǔn):CTCs 陽性-CTCs 數(shù)量≥2 個/5 mL,CTCs 陰性-CTCs數(shù)量<2個/5 mL;CTCs分型判斷標(biāo)準(zhǔn):上皮型CTCs顯示為紅色熒光信號點(CD45 表達(dá)陰性;EpCAM/CK8/CK18/CK19表達(dá)陽性),間質(zhì)型CTCs顯示為綠色熒光信號點(CD45表達(dá)陰性;Vimentin/Twist表達(dá)陽性),混合型CTCs同時顯示紅色和綠色熒光信號點。

    1.3 隨訪 出院后對130 例胃癌患者進(jìn)行隨訪,包括電話和門診復(fù)診,共隨訪3 年,截止日期為2020年7月,終點事件為復(fù)發(fā)和死亡,記錄其無進(jìn)展生存期(progression-free-survival,PFS)和 總 生 存 期 (overall survival,OS)。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),采用χ2檢驗分析CTCs 與胃癌臨床分期的關(guān)系,采用Wilcoxon (W)檢驗分析CTCs 與胃癌療效的關(guān)系,采用Kaplan-Meier法和Log-rank法分析CTCs與胃癌預(yù)后的關(guān)系,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組受檢者的CTCs檢測結(jié)果比較 對照組受檢者CTCs 檢測均為陰性;胃癌組患者中,CTCs 陽性者117例(90.00%),其中CTCs均數(shù)為5(0~42):上皮型均數(shù)為1.8(0~20)、混合型均數(shù)為3.5(0~42)和間質(zhì)型均數(shù)為1.5(0~8),見圖1。

    圖1 CTCs分型(×400)

    2.2 CTCs 與胃癌臨床分期的關(guān)系 CTCs 檢出率在不同T 分期、N 分期和AJCC 分期上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);CTCs 分型在不同 N 分期和AJCC分期上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但在不同T分期上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    2.3 胃癌患者手術(shù)治療前后CTCs 檢出率和CTCs分型比較 術(shù)前、術(shù)后胃癌患者CTCs檢出率和CTCs分型比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    表1 CTCs與胃癌臨床分期的關(guān)系[例(%)]

    表2 胃癌患者手術(shù)治療前后CTCs檢出率和CTCs分型比較[例(%)]

    2.4 CTCs與胃癌預(yù)后的關(guān)系 截至隨訪終止日期,所有胃癌患者均未失訪。117例CTCs陽性胃癌患者中,45 例進(jìn)展,72 例未進(jìn)展;40 例死亡,77 例生存;13例CTCs陰性胃癌患者中,2例進(jìn)展,11例未進(jìn)展;1例死亡,12例生存。CTCs陰性胃癌患者和CTCs陽性胃癌患者無進(jìn)展生存率[85%(11/13)vs 62%(72/117)]和總生存率[92(12/13) vs 66%(77/117)]比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。CTCs陽性胃癌患者中,CTCs 上皮型、混合型和間質(zhì)型的患者無進(jìn)展生存率[(84%(26/31)vs 69%(34/49)vs 32%(12/37)]和總生存率[94%(29/31)vs 73%(36/49)vs 32%(12/37)]比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    圖2 CTCs檢測與胃癌預(yù)后的生存曲線圖

    圖3 CTCs分型與胃癌預(yù)后的生存曲線圖

    3 討論

    近年,我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速,生活環(huán)境和國民生活方式均改變明顯,胃癌發(fā)生率明顯升高,但預(yù)后無明顯改善,與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。1896年,ASHWORTH[12]從在研究轉(zhuǎn)移性腫瘤時發(fā)現(xiàn),患者血液中存在一種與腫瘤細(xì)胞極為相似的血細(xì)胞,并提出了CTCs的概念,表明外周血中檢測到的CTCs 主要來源于原腫瘤灶,通過相關(guān)通路到達(dá)相應(yīng)器官并形成轉(zhuǎn)移灶。有文獻(xiàn)報道,腫瘤患者在某些尚未形成能夠被影像學(xué)所發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移灶之前,外周血中CTCs檢測已存在陽性,提示CTCs檢測對腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)意義重大[13-14]。

    隨后,越來越多研究提示,外周血CTCs在腫瘤診斷、治療及預(yù)后評估中具有重要價值[15]。但由于技術(shù)限制,CTCs在臨床應(yīng)用較少。目前,CTCs檢測方法包括光導(dǎo)纖維陣列掃描(fiber-opticarray scanning technology,F(xiàn)AST)、激光掃描細(xì)胞計量技術(shù)(laser scanning cytometry,LSC)、CTC 芯片技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT) 及 Cell-Search System等,其中最具代表的是經(jīng)美國食品和藥品管理局(food and drug administration,F(xiàn)DA)批準(zhǔn)并用于臨床的 CellSearch 系統(tǒng)[16-17]。與 CellSearch 一代不同,CanPatrolTMCTC-二代捕獲技術(shù)不僅利用納米濾膜快速富集CTCs,還以 EpCAM、CK、Vimentin、Twist、AKT 及Snail 等多種標(biāo)志物mRNA 為靶標(biāo)進(jìn)行RNA原位雜交以進(jìn)行CTCs分型,具有高靈敏性、高特異性及可重復(fù)性等優(yōu)點[18]。

    在本研究中,40 例健康體檢者CTCs 檢測均為陰性,130例胃癌患者中CTCs陽性者117例,檢出率高達(dá)90.00%,與T 分期、N 分期和AJCC 分期相關(guān),分期越晚,CTCs 檢出率越高,提示CTCs 可能通過相關(guān)信號通路參與胃癌的發(fā)生發(fā)展,與楊艷麗等[19]研究結(jié)果基本一致,再次強(qiáng)調(diào)了CTCs在胃癌中的價值。隨后,本研究還探討了CTCs檢出與胃癌手術(shù)治療前后和預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn),術(shù)后CTCs 檢出率明顯低于術(shù)前,CTCs陽性者 PFS 和 OS 均低于 CTCs 陰性者,提示 CTCs 檢測對胃癌療效評估和預(yù)后監(jiān)測有一定價值,為本文重要創(chuàng)新點之一,為胃癌患者診療提供了新的方向。

    研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)腫瘤細(xì)胞在從原發(fā)灶脫離進(jìn)入血液循環(huán)后會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變,根據(jù)此特征可將CTCs可分為上皮型、間質(zhì)型和混合型(上皮-間質(zhì)),以間質(zhì)型惡性程度最高[20]。在本研究117 例CTCs 陽性患者中,上皮型、混合型和間質(zhì)型CTCs 分別為30 例、50 例和 37 例,T 分期、N 分期和 AJCC 分期越晚,間質(zhì)型CTCs占比越大,與前述結(jié)論基本一致。此外,本研究還探討了CTCs分型與胃癌手術(shù)治療前后和預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn),術(shù)前術(shù)后CTCs 分型差異明顯,以間質(zhì)型CTCs 減少為主;CTCs 分型不同,其 PFS 和 OS 比較差異明顯,以間質(zhì)型CTCs 患者PFS 和OS 生存率最低,生存時間最短,提示CTCs 分型在一定程度上可代表胃癌惡性程度,評估其療效,預(yù)測其預(yù)后,在一定程度上可完善胃癌診療系統(tǒng)。

    綜上所述,CTCs 在胃癌中檢出率高,且具有不同分型,與臨床分期、療效及預(yù)后密切相關(guān),綜合CTCs總數(shù)和分型檢測,為胃癌患者診療及預(yù)后提供新的方向。但本研究樣本量和觀察時間均相對有限,今后將通過擴(kuò)大樣本量和延長觀察時間驗證本研究結(jié)論,以便推廣。

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