農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

呂呈蔚，李倬林，李鐵柱，黃 威

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長春 130033）

有機(jī)磷農(nóng)藥（OPPs） 是指在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的含磷有機(jī)化合物農(nóng)藥，主要用作殺蟲劑，少數(shù)用作除草劑、殺菌劑和植物生長調(diào)節(jié)劑[1]。在控制農(nóng)業(yè)病蟲害和提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)量方面發(fā)揮了積極作用。有機(jī)磷農(nóng)藥按結(jié)構(gòu)分為五大類，即磷酸酯類、硫代臨酸酯類、磷酸胺類、焦磷酸酯類和磷酸酯類。多數(shù)呈油狀或白色晶狀粉末，在中性和酸性條件下穩(wěn)定，不易水解。我國常用的有機(jī)磷農(nóng)藥主要有對(duì)硫磷（Parathion）、內(nèi)吸磷（Demeton）、甲拌磷（Phorate）、敵敵畏（Dichlorvos）、甲基對(duì)硫磷（Parathion-methyl）、甲基內(nèi)吸磷（Demeton-methyl）、敵百蟲（Dipterex）、樂果（Dimethoate）、馬拉硫磷（Malathion）、殺螟硫磷（Fenitrothion）、毒死蜱（Chlorpyrifos） 等。綜述了有機(jī)磷農(nóng)藥的危害和常用檢測技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用，為后續(xù)開發(fā)高效、快速和高靈敏度的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測方法提供參考。

1 有機(jī)磷農(nóng)藥的危害

有機(jī)磷農(nóng)藥因其廣譜、高效、快速、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，而被世界各國農(nóng)民廣泛應(yīng)用。長期大量濫用有機(jī)磷農(nóng)藥，使得農(nóng)藥殘留問題日益嚴(yán)重。有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留不僅污染生態(tài)環(huán)境，在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留更是對(duì)人類健康和生命安全造成不同程度的危害[2]。OPPs 的毒性是基于對(duì)人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的抑制，而乙酰膽堿酯酶對(duì)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能至關(guān)重要。大量攝入OPPs 會(huì)出現(xiàn)一系列神經(jīng)中毒癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)呼吸麻痹，甚至死亡。長期接觸或通過飲食攝入低劑量的OPPs，會(huì)出現(xiàn)臟器損傷、致畸、致癌、致突變等[3]。世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示，每年約有20 萬人因直接或間接接觸有機(jī)磷農(nóng)藥導(dǎo)致中毒[4]?？紤]到大量使用有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境具有較大的危害性，我國發(fā)布了GB 23200.93—2016《食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測定》，規(guī)定了食品中有機(jī)磷類農(nóng)藥的最大允許殘留量為0.2 mg/kg。然而，從近幾年的檢測結(jié)果來看，農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的情況不容樂觀。因此，構(gòu)建一種高效、快速、靈敏度高的檢測方法，對(duì)人類和環(huán)境具有重要意義。

2 檢測技術(shù)研究現(xiàn)狀

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS） 是利用氣相色譜作為進(jìn)樣系統(tǒng)，利用質(zhì)譜作為監(jiān)測器對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析，能夠把分子轉(zhuǎn)化生成帶電離子，并在氣態(tài)中根據(jù)質(zhì)荷比（m/z） 的不同將離子分離并檢測。GC-MS 因其高功能及高靈敏度而成為較常用的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測方法。但GC-MS 操作復(fù)雜、檢測成本高、儀器昂貴，以及需要具有一定專業(yè)技術(shù)水平的人員才能操作等缺點(diǎn)，故不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。崔如玉等人[5]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測蔬菜、谷物中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。乙腈作為提取劑，采用DB-35ms 型色譜柱進(jìn)行分離，在多反應(yīng)檢測儀下檢測16 種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。結(jié)果顯示，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.94。所測樣品中16 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率分別為大米75.9%～112.2%，面粉77.3%～126.9%，蔬菜76.2%～125.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） ≤8.5%。馬妍等人[6]采用固相萃取-分散液液微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定中草藥類保健食品中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。用含0.5%甲酸的乙腈作為提取劑，經(jīng)分散固相萃取管（d-SPE） 凈化后，采用分散液液微萃取，用氯仿濃縮目標(biāo)物。結(jié)果顯示，在最優(yōu)的條件下，線性范圍為0.05～1.00 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，檢出限（LOD） 為0.3～3.0 μg/kg，有機(jī)磷農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為70.3%～107.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） ＜10%。

2.2 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS） 結(jié)合了液相色譜超強(qiáng)的分離能力與質(zhì)譜超強(qiáng)的組分鑒定能力，是一種分離及鑒定復(fù)雜有機(jī)混合物的有效手段。特別適用于沸點(diǎn)高、穩(wěn)定性差和揮發(fā)性低的化合物。與GC-MS 相比，HPLC-MS 選擇性好、干擾因素少，且兼具分離、定量和定性于一體，因此特別適用于有機(jī)磷化合物的檢測。但該方法也存在著一定的局限性，前處理繁雜、耗時(shí)長、檢測成本高、不適用現(xiàn)場檢測分析等。王雯等人[7]建立了一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測黃瓜中5 種具有代表性的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。用丙酮作為提取劑，佛羅里硅土凈化，以甲醇- 水為流動(dòng)相，采用ZORBAX SB-C18型色譜柱進(jìn)行分離，電噴霧離子化正模式（ESI+） 離子化，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM） 的條件下測定。結(jié)果顯示，方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好R2≥0.988，樂果與敵敵畏的定量限為0.002 mg/kg，敵百蟲、殺螟硫磷和毒死蜱的定量限為0.01 mg/kg；回收率為72%～98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） ≤3.6%。梁達(dá)清等人[8]采用HPLC-MS 法檢測香菇中23 種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。用乙腈作為提取劑、鹽析分配，C18和N-丙基乙二胺粉末萃取凈化，采用VenusiIMP 色譜柱，電噴霧正離子方式及多反應(yīng)監(jiān)測模式的條件下測定。結(jié)果顯示，該方法定量限為0.01 mg/kg，回收率為70.2%～105.0%，RSD 值為3.5%～13.0%。

2.3 酶抑制法

早在20 世紀(jì)50 年代酶抑制法就已應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測。酶抑制法是指在一定條件下，酯酶可以水解催化羧酸酯類有機(jī)物，有機(jī)磷類化合物能夠抑制酯酶的活性，使酯酶失去催化作用，其抑制率與有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)，通過抑制率可以對(duì)樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行定性和半定量分析[9]。酶抑制法在檢測時(shí)反應(yīng)時(shí)間短、快速、操作簡便，但是由于酶試劑易失活。因此，該方法結(jié)果不穩(wěn)定且重復(fù)性較差。于基成等人[10]采用酶抑制法檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，小麥為對(duì)照試驗(yàn)，比較了大豆、玉米等10 種植物中植物酯酶活性，系統(tǒng)地優(yōu)化了酶促反應(yīng)條件。研究結(jié)果表明，在最優(yōu)的條件下，該方法的回收率為86.7%～97.1%，對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、甲胺磷、久效磷和毒死蜱5 種有機(jī)磷農(nóng)藥的最小檢出限為0.13～0.24 μg/mL。邱朝坤等人[11]以鯽魚腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶（AChE） 為檢測用酶，檢測白菜、青椒、西紅柿、豆角、空心菜5 種蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)AChE 的抑制曲線方程，判斷樣品中農(nóng)藥殘留。結(jié)果表明，5 種蔬菜中均未出現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留超標(biāo)。除豆角外，此方法回收率為80%～20%，說明該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確可信。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 利用酶標(biāo)記抗原或抗體以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種非均相的免疫分析法。其基本原理是使抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面與某種酶結(jié)合成酶標(biāo)抗原或抗體，在底物的參與下，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與待測抗原或抗體成比例，因此可根據(jù)顏色的深淺或酶標(biāo)儀測定，來確定待測物是否存在及其含量[12]。ELISA 檢測速度快、靈敏度高，無需昂貴的設(shè)備，使該方法易于實(shí)施，更加適用于現(xiàn)場大批量樣本檢測。而ELISA 所利用的乙酰膽堿酯酶、植物酯酶等具有制備成本高、受天然條件限制的缺點(diǎn)。鄒茹冰等人[13]建立了一種化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法，可以同時(shí)檢測對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷和殺螟硫磷3 種有機(jī)磷農(nóng)藥，比較了間接競爭和直接競爭2 種模式。試驗(yàn)結(jié)果表明，間接競爭檢測的3 種有機(jī)磷農(nóng)藥抑制中質(zhì)量濃度（IC50） 分別為對(duì)硫磷5.57 μg/kg，甲基對(duì)硫磷2.30 μg/kg，殺螟硫磷2.62 μg/kg，檢測線性范圍分別為0.39～100 μg/kg，0.39～25 μg/kg，0.39～25 μg/kg；直接競爭檢測3 種有機(jī)磷農(nóng)藥抑制中質(zhì)量濃度（IC50）分別為對(duì)硫磷5.43 μg/kg，甲基對(duì)硫磷1.34 μg/kg，殺螟硫磷1.24 μg/kg，檢測線性范圍分別為0.39～100.00 μg/kg，0.10～25 μg/kg，0.10～25 μg/kg。

2.5 生物傳感器

生物傳感器由識(shí)別元件（如酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、核酸等生物活性物質(zhì)） 和轉(zhuǎn)換元件（如電極、光學(xué)探測器、場效應(yīng)管等） 及檢測元件組成。生物傳感器是以生物敏感元件特異性識(shí)別生物活性物質(zhì)或特定化學(xué)物質(zhì)，通過檢測pH 值、電子或特定離子等物理化學(xué)信號(hào)的變化，并將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過檢測元件放大、測量結(jié)果可以直接顯示在屏幕上[14-15]。與GC-MS，HPLC-MS 相比，生物傳感器簡單、快速、選擇性高、成本低、專一性和抗干擾能力強(qiáng)，因此特別適用于有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的檢測[16]。但此方法也存在著缺點(diǎn)，如回收率不高、可重現(xiàn)性不理想。Zhang J 等人[17]提出了一種實(shí)時(shí)和超痕量檢測4 種有機(jī)磷農(nóng)藥的微型交叉電極型傳感器，在微交錯(cuò)電極芯片表面修飾DNA 適配體，利用交流電動(dòng)力學(xué)加速有機(jī)磷分子與適配體探針結(jié)合，其電容變化率作為識(shí)別元件的定量指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器具有較寬的線性范圍為fM～nM，對(duì)水胺硫磷、丙溴磷、氧化樂果、甲拌磷4 種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測限為0.24～1.67 fM。Jinal B 等人[18]將乙酰膽堿酯酶通過酰胺鍵直接摻雜在羧基修飾的多壁碳納米管表面，用于現(xiàn)場快速檢測有機(jī)磷農(nóng)藥。其原理是將帶羧基的碳納米管沉積在玻碳電極上，然后用乙酰膽堿酯酶固定化，固定化之后用循環(huán)伏安法測定乙酰膽堿酯酶的活性，采用掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡對(duì)電極表面進(jìn)行了表征。在優(yōu)化參數(shù)的條件下，電極的線性范圍為10～50 nM，傳感器的檢測下限為0.1 nM，檢測上限為500 nM。

3 結(jié)語

圍繞有機(jī)磷農(nóng)藥殘留對(duì)人類的危害展開論述，詳細(xì)介紹了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶抑制法、酶聯(lián)免疫吸附法和生物傳感器法在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用。但是上述各有利弊，其中氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有選擇性好、檢測精度高、定量檢測效果好等優(yōu)點(diǎn)，但需要具有一定專業(yè)技術(shù)水平的人員才能操作，且檢測儀器昂貴，故不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測；酶抑制法、酶聯(lián)免疫吸附法、生物傳感器法具有操作簡便、高效快速等優(yōu)點(diǎn)，適合現(xiàn)場檢測樣品的快速初步篩選，而酶抑制法與酶聯(lián)免疫吸附法利用的乙酰膽堿酯酶、植物酯酶等具有制備成本高、受天然條件限制的缺點(diǎn)?？紤]到有機(jī)磷農(nóng)藥殘留對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境存在的潛在危害。因此，建立高效、快速和靈敏度高的定性定量分析方法具有重要意義。