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    滑胎安胎協(xié)定方調(diào)節(jié)PI3K信號通路對腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響*

    2020-12-20 03:47:04張旻軼樓毅云
    浙江中醫(yī)雜志 2020年12期

    張旻軼 樓毅云 傅 萍#

    1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 浙江 杭州 310053

    2 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

    3 杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

    復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)大多為早期妊娠丟失,是孕期常見現(xiàn)象,中醫(yī)學(xué)將本病歸之于“墮胎”“滑胎”等范疇。本研究在前期臨床及實驗研究的基礎(chǔ)上,從腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)入手,觀察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號通路的相關(guān)分子血清和糖皮質(zhì)激素激酶1(SGK1)、SGK2、SGK3以及子宮內(nèi)膜蛻膜化標(biāo)志分子泌乳素(PRL)在腎虛型復(fù)發(fā)性自然者蛻膜組織中的mRNA的表達,以及應(yīng)用滑胎安胎協(xié)定方后蛻膜細胞中SGK1和PRL的相對表達,以探討滑胎安胎協(xié)定方對妊娠早期子宮內(nèi)膜蛻膜化的進程的影響。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料:經(jīng)杭州市中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),符合中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和納入標(biāo)準(zhǔn)[1-2],選取2013年1月~2018年12月期間在杭州市中醫(yī)院就診的妊娠早期(妊娠12周之前)者為研究對象,其中正常早期妊娠要求人工流產(chǎn)者26例作為正常對照組,年齡21~43歲,平均28.69±1.39歲;人工流產(chǎn)次數(shù)0~2次,平均0.20±0.09次;孕周6~10周,平均8.04±0.23周。腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)26例為實驗組,年齡19~37歲,平均27.96±0.89歲;自然流產(chǎn)次數(shù)2~3次,平均2.00±0.11次;孕周7~11周,平均8.50±0.26周。兩組資料比較,無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

    1.2 蛻膜收集及處理:收集流產(chǎn)者子宮蛻膜組織,50ml離心管,預(yù)先分裝生理鹽水,按上述納入和排除標(biāo)準(zhǔn)分組收集對照組和實驗組蛻膜組織,將清宮術(shù)中取出的蛻膜組織放入生理鹽水中,置于冰盒內(nèi),術(shù)后1小時內(nèi)帶回實驗室。生理鹽水充分洗滌蛻膜組織,盡量除去血塊及血細胞,吸水紙吸凈蛻膜組織表面生理鹽水,剪碎后凍存管分裝,液氮中凍存1小時,在-80℃冰箱凍存。

    1.3 藥物制備:受試藥物制備按本研究組前期臨床研究方案制備[3]。精密稱取菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根各200g,阿膠、當(dāng)歸、杭白芍各150g(滑胎安胎協(xié)定方),碾碎制成粗粉,混合后回流提取,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,之后濾過,濾液減壓回收定容,至250ml,滅菌分裝備用;取1ml滑胎安胎協(xié)定方混合提取物(2g/ml),加入培養(yǎng)液后配制母液(30mg/ml),EP管分裝,放于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 蛻膜細胞培養(yǎng):無菌條件下取得正常妊娠早期人流術(shù)后蛻膜組織,放入1%雙抗的培養(yǎng)基,用消毒的眼科剪將蛻膜組織剪碎,消化過濾,1000rpm離心,裂解后置于5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。用上述制備的滑胎安胎協(xié)定方受試藥物處理蛻膜細胞,設(shè)為中藥組,培養(yǎng)過夜,并設(shè)同期對照組。

    1.5 Real-time PCR法檢測PI3K信號通路相關(guān)分子mRNA的表達:Trizol一步法提取蛻膜組織和培養(yǎng)后蛻膜細胞的總RNA,總RNA濃度測定后進行PCR擴增,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法測定蛻膜組織中SGK1、SGK2、SGK3、PRL、PKD1、CD44和CD44v6的mRNA表達水平,以及測定蛻膜細胞對照組和中藥處理組中SGK1和PRL的mRNA表達水平。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS16.0軟件分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示,進行t檢驗及方差分析。以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 子宮蛻膜組織中PI3K信號通路相關(guān)分子的mRNA表達:對納入本研究的26例正常早期妊娠者(對照組)和同期26例腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者(實驗組)的子宮蛻膜組織中SGK1 mRNA水平進行分析,發(fā)現(xiàn)實驗組蛻膜組織中的SGK1 mRNA表達較對照組下降(P<0.01),本研究印證了我們前期的研究結(jié)果[3]。見圖1。

    圖1 正常對照組與實驗組蛻膜組織中SGK1 mRNA表達

    圖2 正常對照組與實驗組蛻膜組織中PI3K信號通路上相關(guān)分子的mRNA表達

    以GAPDH為內(nèi)參,對SGK1的另兩個亞型SGK2和SGK3、PRL、PDK1、CD44及CD44v6在正常對照組和實驗組蛻膜組織中的表達進行Real time PCR分析,SGK2和SGK3這兩個SGK的異構(gòu)酶在實驗組蛻膜組織中的mRNA表達低于同期正常對照組(P<0.01);子宮內(nèi)膜蛻膜化標(biāo)志分子PRL在實驗組蛻膜組織中的相對表達量亦低于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

    2.2 滑胎安胎協(xié)定方對蛻膜細胞中SGK1、PRL mRNA表達的影響:以滑胎安胎協(xié)定方處理蛻膜細胞,本研究應(yīng)用Real time PCR分析對照組以及中藥組蛻膜細胞中SGK1和PRL的表達。SGK1在滑胎安胎協(xié)定方處理組中的相對表達量高于對照組(P<0.05)。子宮內(nèi)膜蛻膜化標(biāo)志分子PRL在中藥組蛻膜細胞中的相對表達量亦顯著高于對照組(P<0.01)。見圖3。

    圖3 滑胎安胎協(xié)定方對蛻膜細胞中SGK1、PRL mRNA表達的影響

    3 討論

    復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)病因復(fù)雜,目前胚胎染色體核型異常是公認病因,但隨著自然流產(chǎn)次數(shù)的增加,胚胎染色體異常的機率下降,提示其他主導(dǎo)機制的存在,如解剖學(xué)、免疫學(xué)、內(nèi)分泌、微生物學(xué)以及血栓性疾病等[4-5]。中醫(yī)學(xué)對本病的認識由來已久,《諸病源候論》列有“妊娠漏候”“妊娠胎動候”,指出“妊娠而恒腰痛者”,為“喜墮胎”之候,提示腎與胞胎的關(guān)系。胎者泰然蓬生,若腎氣乏,則沖任不固,胞胎難系[6]。因此,本研究選取腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)作為研究對象。

    本研究所用滑胎安胎協(xié)定方(菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根、阿膠、當(dāng)歸、杭白芍)系名老中醫(yī)臨證經(jīng)驗方,方中菟絲子滋補肝腎、固精安胎,是為君藥;覆盆子添精補髓、疏利腎氣,是為臣藥;桑寄生益肝腎祛風(fēng)濕,苧麻根清熱涼血止血,阿膠養(yǎng)血補血滋陰,杭白芍養(yǎng)血和營柔肝。全方溫而不燥,補而不滯,共同起到益腎安胎的作用。根據(jù)藥物組成的性味功效分析,滑胎安胎協(xié)定方對腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)有治療效應(yīng)。

    本研究結(jié)果表明腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)者子宮蛻膜中PI3K信號通路上相關(guān)分子SGK1、SGK2、SGK3、PRL的mRNA表達顯著降低,腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)與子宮蛻膜中PI3K-SGK1通路的下調(diào)相關(guān)?;グ蔡f(xié)定方提高蛻膜細胞中SGK1、PRL的表達,可通過調(diào)節(jié)PI3K信號通路,影響子宮內(nèi)膜蛻膜化的正常進行,維持妊娠的正常進程,改善妊娠結(jié)局。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,進一步闡述妊娠早期PI3K及其信號通路上相關(guān)分子的表達影響妊娠進程的機理,為中醫(yī)補腎治療提供分子理論基礎(chǔ),為中醫(yī)藥防治復(fù)發(fā)性流產(chǎn)研究提供新的思路。

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