益氣養(yǎng)陰解毒方對(duì)胃癌前病變大鼠Th17/Treg平衡的影響

湯小芳 楊晴柔 陳芝蕓 何蓓暉 嚴(yán)茂祥#

1 桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院 浙江 嘉興 314505

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

胃的癌前病變(PLGC)是正常胃黏膜發(fā)展到胃癌的重要階段，積極干預(yù)胃癌前病變是降低胃癌發(fā)生率的有效措施。近年研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生發(fā)展與輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）平衡失調(diào)而引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸相關(guān)[1]。筆者在臨床上采用益氣健脾、滋肝補(bǔ)腎、清熱解毒為治療原則的“益氣養(yǎng)陰解毒方”治療慢性萎縮性胃炎伴腸化/異型增生取得較好療效[2-3]。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本研究采用新生大鼠短期灌服致癌劑誘導(dǎo)胃癌前病變模型，并以Th17/Treg平衡為切入點(diǎn)，闡述益氣養(yǎng)陰解毒方防治胃癌前病變的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物：4～5周齡Sprague Dawley（SD）大鼠，雌性10只，雄性5只，SPF級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（滬）2012-0002】；在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)至2+月齡，以雌雄比2∶1進(jìn)行配種，自由飲水采食，雌性大鼠懷孕后單籠喂養(yǎng)，選取出生3日的雄性乳鼠進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑：益氣養(yǎng)陰解毒方由黃芪、黨參、熟地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮、白花蛇舌草、仙鶴草、莪術(shù)組成，按 2∶1.5∶2∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶2.5∶2.5∶2.5∶1比例，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制成流浸膏，每毫升含生藥2.565g。1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG）由東京化成工業(yè)株式會(huì)社提供；Bio-Plex EXP Rat Cyto Group Kit、Bio-Plex ProTMRat IL17A、IL-6、IL10 Standard、Bio-Plex ProTMRat TGF-β1 Standard由美國(guó)Bio-Red公司提供；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司提供；CHamQTM SYBRR qPCR Master Mix由南京諾唯贊生物科技有限公司提供；總蛋白提取試劑盒、BCA定量試劑盒由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.3 主要儀器：Bio-Rad CFX Touch熒光定量PCR儀、Bio-Plex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Red公司；Bertin Precellys-24生物樣品均質(zhì)器為法國(guó)Bertin Technologies公司；Thermo Varioskan Flash全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)THERMO Electron公司。

2 方法

2.1 分組及處理：出生3d雄性乳鼠52只分為正常組14只，造模組38只。各乳鼠均與母鼠同養(yǎng)，常規(guī)母乳喂養(yǎng)，每日上午各乳鼠禁食2h后正常組灌胃生理鹽水、造模組灌服800μg/ml的MNNG，均0.1ml/只，連續(xù)10d；所有乳鼠于3周齡斷乳并分籠，常規(guī)自由飲食和飲水。以灌胃MNNG結(jié)束次日為觀察第1天，第22周末兩組各處理大鼠6只，空腹麻醉下處死，分離胃組織，沿胃大彎剖開，用生理鹽水沖洗，中性甲醛固定，HE染色觀察胃黏膜病理變化。剩余造模組24只大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組8只，剩余正常組8只仍為正常組；第23周起，正常組、模型組每天灌服0.9%NaCl溶液10ml/kg，中藥高、低劑量組每天分別灌服25.65g/kg、8.55g/kg的益氣養(yǎng)陰解毒方流浸膏，均連續(xù)用藥12周后，按上述方法處理大鼠，收集胃組織標(biāo)本，觀察胃黏膜肉眼變化，取胃竇至胃體長(zhǎng)條組織在中性甲醛中固定用于病理觀察，其余胃組織-75℃待用。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)：胃黏膜病理學(xué)檢測(cè)采用HE染色，參考中國(guó)慢性胃炎共識(shí)（2012年，上海）[4]和異型增生病變Pavoda國(guó)際分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]，光鏡下觀察胃黏膜炎癥、萎縮、腸化、異型增生、腺瘤等情況。胃黏膜FoxP3mRNA、RORγt mRNA表達(dá)采用qRT-PCR法檢測(cè)，引物由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計(jì)合成，F(xiàn)oxP3上游引物：5'-ACT GCC AAG CAG ATC ACC TC-3’，下游引物：5'-CTG CAT AGC TCC CAG CTT CT-3’，擴(kuò)增片段：122bp；RORγt上游引物：5'-GAG GCC ATT CAG TAC GTG GT-3’，下游引物：5'-CTG ACG AGG ACG ACT TCC AT-3’，擴(kuò)增片段：116bp；β-actin上游引物：5'-TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3’，下游引物：5'-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3’，擴(kuò)增片段：155bp。采用總蛋白提取試劑盒提取胃黏膜蛋白，以BCA法定量胃黏膜總蛋白濃度，采用液相懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)血清和胃黏膜白介素-17（IL-17A）、白介素-6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白介素-10（IL-10）等水平。

3 結(jié)果

3.1 益氣養(yǎng)陰解毒方對(duì)胃癌前病變大鼠胃黏膜病理影響：HE染色光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞完整，腺體排列整齊、規(guī)則，細(xì)胞核位于基底部。造模后22周末所有大鼠可見胃黏膜有淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎細(xì)胞的浸潤(rùn)，半數(shù)大鼠腺體略減少，排列稍紊亂，個(gè)別細(xì)胞腺體囊狀擴(kuò)張，并出現(xiàn)輕度異型增生，所有大鼠胃黏膜腸上皮化生均不明顯；至造模后35周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，模型組大鼠胃黏膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，腺體排列紊亂加重，8例大鼠均有低或高級(jí)別異型增生，其中2例還可見高分化腺癌形成；仍未見明顯腸上皮化生。各藥物干預(yù)組大鼠胃黏膜也可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分大鼠胃黏膜腺體稍減少，排列有紊亂，個(gè)別細(xì)胞腺體囊狀擴(kuò)張及異型增生，以低級(jí)或不確定為主，見圖1。35周模型組大鼠胃黏膜炎癥、萎縮及異型增生等積分較正常組明顯增高（P＜0.05、P＜0.01），中藥低、高劑量組炎癥程度較模型組明顯降低（P＜0.05、P＜0.01），萎縮程度與模型組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；異型增生等程度較模型組明顯減輕（P＜0.05、P＜0.01）。見表1～表3。

圖1 大鼠胃黏膜病理（HE×100）

表1 各組大鼠胃黏膜炎癥程度比較（n=8,例）

表2 各組大鼠胃黏膜萎縮程度比較（n=8,例）

表3 各組大鼠胃黏膜癌前病變的比較（n=8,例）

3.2 益氣養(yǎng)陰解毒方對(duì)胃癌前病變大鼠胃黏膜RORγt、FoxP3mRNA表達(dá)的影響：模型組大鼠胃黏膜RORγtmRNA表達(dá)、RORγt/FoxP3比值較正常組顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，F(xiàn)oxP3mRNA則與正常組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，中藥低、高劑量組RORγtmRNA表達(dá)、RORγt/FoxP3比值較模型組明顯下降（P＜0.01、P＜0.05）。見圖2。

圖2 大鼠胃黏膜RORrt、FOXp3mRNA表達(dá)及比值（n=8）

圖3 各組大鼠血清IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10水平（n=8）

圖4 各組大鼠胃黏膜蛋白提取液IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10水平（n=8）

3.3 益氣養(yǎng)陰解毒方對(duì)胃癌前病變大鼠血清、胃黏膜IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β水平的影響：與正常組相比，模型組血清IL-17A、TGF-β和IL-6含量和胃黏膜IL-17A、TGF-β含量均顯著增高(P＜0.05、P＜0.01)；與模型組比，中藥高、低劑量組血清IL-17A、IL-6和TGF-β含量、胃黏膜IL-17A、TGF-β含量以及中藥高劑量組血清TGF-β含量明顯降低(P＜0.01、P＜0.05)。見圖3～圖4。

4 討論

胃黏膜萎縮伴腸上皮化生或異型增生屬于胃癌前病變。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”“痞滿”等范疇；主要病機(jī)是脾胃虛弱、肝腎虧損、熱毒邪結(jié)。據(jù)此，筆者創(chuàng)立益氣養(yǎng)陰解毒方。方中黃芪、黨參補(bǔ)中益氣；熟地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮滋補(bǔ)肝腎；白花蛇舌草、仙鶴草、莪術(shù)清熱理氣解毒。諸藥共奏益氣健脾、滋肝補(bǔ)腎、清熱解毒之功。

本研究發(fā)現(xiàn)，益氣補(bǔ)腎解毒方能減輕炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，改善或逆轉(zhuǎn)大鼠胃黏膜異型增生，阻止胃癌前病變的進(jìn)展，尤以高劑量效果明顯。與正常組相比，模型組大鼠 胃 黏 膜 RORγtmRNA表 達(dá) 上 調(diào) 、RORγtmRNA/FoxP3mRNA比值增高(P＜0.01)，血清和胃黏膜IL-17A和TGF-β水平以及胃黏膜IL-6水平均明顯增高(P＜0.01、P＜0.05)，提示新生大鼠短期灌服致癌劑MNNG誘導(dǎo)的胃癌前病變模型大鼠胃黏膜局部微環(huán)境發(fā)生了變化，促炎因子分泌增加，存在著Th17/Treg免疫失衡。益氣補(bǔ)腎解毒方干預(yù)后，大鼠胃黏膜組織RORγtmRNA表達(dá)下調(diào)、RORγt/FoxP3比值下降，血清和胃黏膜蛋白提取液IL-17A、TGF-β水平和胃黏膜蛋白提取液IL-6水平降低；表明通過(guò)調(diào)控RORγt、Foxp3等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)以及炎癥因子IL-17A、IL-6、TGF-β的水平，該方能一定程度糾正Th17/Treg失衡進(jìn)而緩解減輕或逆轉(zhuǎn)胃黏膜炎癥及異型增生。