腐植酸對(duì)土壤微生物和酶活性的影響

董睿瀟 莫力聞 劉丹陽 施嘉明 史 記 元 野 馬獻(xiàn)發(fā)*

1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 哈爾濱 150030

2 中國煙草總公司黑龍江省分公司牡丹江煙草科學(xué)研究所 哈爾濱 150001

土壤微生物與酶活性是表征土壤肥力的重要指標(biāo)，兩者在土壤的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流動(dòng)過程中起著極其重要的作用[1]。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，參與并推動(dòng)著土壤有機(jī)質(zhì)的分解和礦質(zhì)元素的轉(zhuǎn)化[2]。其中，微生物量碳、氮被認(rèn)為是土壤中植物有效養(yǎng)分的儲(chǔ)存庫和植物生長可利用養(yǎng)分的重要來源[3]。土壤酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)新陳代謝的重要?jiǎng)恿Γ彩峭寥乐懈鞣N生物化學(xué)反應(yīng)良好的催化劑[4]，其活性可以反映出不同土壤生物化學(xué)反應(yīng)的相對(duì)強(qiáng)度和土壤的養(yǎng)分狀況[5]。例如，土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶等水解酶活性能夠表征土壤碳、氮、磷等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化強(qiáng)度[6]。腐植酸是廣泛存在于自然界中的一類芳香族富含酸性基團(tuán)的高分子縮合物[7]，通常呈黑色或褐色的膠體狀態(tài)。由于腐植酸具有良好的吸收、絡(luò)合、交換、緩沖能力和生理活性，它在改良土壤結(jié)構(gòu)和提高土壤肥力等方面具有重要作用，同時(shí)也會(huì)直接或間接影響土壤微生物和酶活性。

雖然已有試驗(yàn)證明，施用腐植酸能促進(jìn)土壤微生物的活動(dòng)，顯著增加土壤細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量和提高土壤酶活性。但腐植酸與土壤微生物及土壤酶活性關(guān)系的研究還有待于進(jìn)一步完善[8]。本文在介紹施用腐植酸對(duì)土壤微生物數(shù)量、多樣性和參與碳、氮、磷轉(zhuǎn)化等關(guān)鍵酶活性影響的基礎(chǔ)上，對(duì)腐植酸改善土壤微生物和酶活性的作用機(jī)理進(jìn)行綜述，以期為腐植酸在提高土壤質(zhì)量等方面的應(yīng)用研究提供參考。

1 腐植酸對(duì)土壤微生物及酶活性的影響

1.1 腐植酸對(duì)土壤微生物的影響

1.1.1 腐植酸對(duì)土壤微生物量的影響

土壤微生物量是指土壤中除了活的植物體（如植物根系等）外，體積小于5×103μm3的生物總量[9]，是土壤有機(jī)質(zhì)中最活躍和最易變化的部分[10]。土壤微生物量代表了參與土壤中養(yǎng)分循環(huán)和有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的微生物數(shù)量[11]，是衡量土壤肥力水平和土壤質(zhì)量的重要生物學(xué)指標(biāo)[12]。

廣義的土壤微生物量包括微生物量碳、氮、磷、硫等。已有研究證實(shí)，施用褐煤腐植酸能顯著增加土壤微生物量碳、氮、磷含量，且連續(xù)施用年限越久，增強(qiáng)效果越好；但褐煤腐植酸對(duì)土壤微生物量碳、氮、磷含量影響程度不同，多年施用后對(duì)土壤微生物量磷的影響大于對(duì)土壤微生物量碳、氮[13]。此外，腐植酸與土壤改良劑結(jié)合起來施用更能充分發(fā)揮其增加土壤微生物量的潛力?，F(xiàn)有研究證實(shí)腐植酸與生物炭配合使用具有累積效應(yīng)，對(duì)土壤微生物量碳、氮、磷的增長幅度更大[14]。

1.1.2 腐植酸對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

施用腐植酸能顯著提高土壤三大類群微生物（細(xì)菌、真菌和放線菌）的數(shù)量。首先，不同用量水平的腐植酸均可明顯增加土壤中三大類群微生物的數(shù)量[15]。其次，當(dāng)選取其他等養(yǎng)分的施肥處理作對(duì)比時(shí)，腐植酸肥處理的土壤中三大類群微生物的數(shù)量明顯高于這些施肥處理[16]，這進(jìn)一步明確了腐植酸對(duì)土壤微生物數(shù)量的促進(jìn)作用。

隨著腐植酸用量的增加，土壤微生物菌群數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。袁婉潼[17]和Sellamuthu等[18]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然施用腐植酸會(huì)顯著增加土壤中各類微生物的數(shù)量，但隨著腐植酸投入量的增加，各種微生物的數(shù)量均表現(xiàn)出先增加后減少的變化規(guī)律。

不同用量的腐植酸對(duì)三大菌群數(shù)量的影響效果不同。研究表明，相較于不施肥處理，腐植酸處理的種群數(shù)量同比增長顯著，且提高幅度以細(xì)菌最高，真菌次之，放線菌最低[19]。

1.1.3 腐植酸對(duì)土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中所有的微生物種類、它們擁有的基因以及這些微生物與環(huán)境之間相互作用的多樣化程度，可以從物種多樣性、功能多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性及遺傳多樣性等不同層面分析[20]。

腐植酸對(duì)土壤微生物群落物種變化度、差異度和均一性具有一定影響。相關(guān)試驗(yàn)證明，施用腐植酸的土壤微生物群落的Shannon指數(shù)（評(píng)估物種豐富度）和McIntosh指數(shù)（評(píng)估物種均勻度）均顯著增長，且在一定程度上隨腐植酸的施用量增加而增加。Yi等[21]也證實(shí)這一觀點(diǎn)，在土壤中加入不同質(zhì)量比的腐植酸（0.2%～1.5%）可增加微生物群落的豐度，低劑量的腐植酸（0.2%）對(duì)微生物群落沒有明顯影響，高劑量的腐植酸（0.5%～1.5%）對(duì)微生物群落有明顯影響，例如將甲烷桿菌的相對(duì)豐度從13.7%提高到23.7%，深古菌的相對(duì)豐度從8.9%提高到45.6%。由此可見，在一定的濃度范圍內(nèi)腐植酸能提高土壤微生物群落物種的豐度和均勻度[22]。高通量測序技術(shù)也證實(shí)了腐植酸可以顯著增加細(xì)菌和真菌的多樣性，在玉米抽雄期和生育期，用量為3.75 t/hm2腐植酸處理的細(xì)菌OTUs（定義為97%的序列相似性）數(shù)量相比不施肥處理提高7.44%和4.82%。在玉米六葉期、抽雄期和生育期，腐植酸處理的真菌OTUs數(shù)量相比不施肥處理提高28.92%、30.81%和8.73%[23]。

同樣，腐植酸可以通過改善土壤微生物的整體代謝活性影響其多樣性。通常選定平均顏色變化率（AWCD）反映土壤微生物的代謝活性和其對(duì)碳源的利用程度，其值越大，表示微生物密度越大，活性越高[24]。劉佳歡等[25]的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，施用腐植酸肥料可以顯著提高土壤微生物的AWCD，且施用量越多，AWCD越高。譚兆贊等[26]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生化腐植酸處理的AWCD較等養(yǎng)分無機(jī)肥對(duì)照最大提高39.3%。因此，可以認(rèn)為施用腐植酸肥料能促進(jìn)土壤微生物的整體代謝活性，增強(qiáng)微生物對(duì)碳源的利用能力。

1.2 腐植酸對(duì)土壤酶活性的影響

1.2.1 腐植酸對(duì)土壤脲酶活性的影響

脲酶是一種作用于線型酰胺鍵的酶，它能催化尿素水解生成氨、二氧化碳等小分子無機(jī)化合物[27]，是參與土壤氮循環(huán)過程的一種重要的酶。整體來看，腐植酸對(duì)土壤脲酶活性具有一定的抑制作用。研究表明，在施肥區(qū)或無肥區(qū)的土壤上增施腐植酸都會(huì)對(duì)原有條件下的土壤脲酶活性起到抑制作用[27]。從作用時(shí)期來看，腐植酸一般在作物生育前期表現(xiàn)出對(duì)脲酶活性的抑制作用，而在后期卻無明顯的抑制作用或表現(xiàn)出對(duì)土壤脲酶活性的促進(jìn)作用。李作梅等[28]的研究證實(shí)了這一觀點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)不同施肥處理下的土壤脲酶活性變化趨勢(shì)是相同的，但施用腐植酸肥料處理的土壤脲酶活性同比前期降低，后期提高。此外，3種不同來源的腐植酸對(duì)土壤脲酶活性的影響程度存在一定的差異。在培養(yǎng)前期均表現(xiàn)出對(duì)土壤脲酶活性的抑制作用，且以褐煤腐植酸表現(xiàn)最佳，泥炭腐植酸次之，風(fēng)化煤腐植酸再次之。這有利于抑制尿素的水解，延長尿素的肥效；而在培養(yǎng)后期，泥炭腐植酸對(duì)脲酶活性具有一定的促進(jìn)作用，這有利于后期尿素肥效的發(fā)揮[29]。

1.2.2 腐植酸對(duì)土壤過氧化氫酶活性的影響

土壤過氧化氫酶促進(jìn)過氧化氫分解生成水和氧氣，有利于防止過氧化氫對(duì)土壤和植物的毒害作用[30]。關(guān)于腐植酸對(duì)土壤過氧化氫酶的影響，科學(xué)界一直持有兩種觀點(diǎn)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，腐植酸具有提高土壤過氧化氫酶活性的能力。腐植酸的施入促進(jìn)了土壤微生物的活動(dòng)，加強(qiáng)了土壤氧化過程的強(qiáng)度[31]，且試驗(yàn)證實(shí)，腐植酸通過降低鎘的有效性而增加過氧化氫酶的活性[32]。但也有人持有相反的觀點(diǎn)，認(rèn)為腐植酸具有抑制土壤過氧化氫酶活性的能力。一方面是在施用腐植酸多年后，某些用量水平下的腐植酸呈現(xiàn)出抑制土壤過氧化氫活性的效果[33]；另一方面，有試驗(yàn)證實(shí)泥炭、褐煤和風(fēng)化煤來源的腐植酸處理均能夠?qū)^氧化氫酶活性起到抑制作用，使土壤去除土體內(nèi)過氧化氫的能力減弱，且以褐煤腐植酸的抑制作用最為突出，其次為風(fēng)化煤腐植酸，泥炭腐植酸的作用最弱[29]。這些研究結(jié)果的差異可能與施用腐植酸種類、施用量、時(shí)間、施用方式及試驗(yàn)提供的土壤類型不同有關(guān)。因此，腐植酸對(duì)土壤過氧化氫酶活性的影響有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.3 腐植酸對(duì)土壤磷酸酶活性的影響

磷酸酶能夠催化土壤有機(jī)磷化合物礦化，其活性高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解、轉(zhuǎn)化及生物有效性，是評(píng)價(jià)土壤磷素轉(zhuǎn)化方向的重要指標(biāo)[34]。腐植酸能夠顯著提高土壤酸性磷酸酶的活性，腐植酸和無機(jī)肥配合施用具有累加效應(yīng)，其處理對(duì)改善酸性磷酸酶活性的效果更佳[35]。對(duì)于中性磷酸酶而言，不同來源的腐植酸對(duì)其活性具有不同程度的促進(jìn)作用。以褐煤腐植酸最佳，風(fēng)化煤腐植酸次之，最后為泥炭腐植酸。此外，不同來源的腐植酸對(duì)酶活性的作用時(shí)期也不同，褐煤腐植酸在整個(gè)培養(yǎng)期對(duì)中性磷酸酶活性起到較好的促進(jìn)作用；風(fēng)化煤腐植酸僅在培養(yǎng)前期對(duì)其活性表現(xiàn)出最佳效果；而泥炭腐植酸在培養(yǎng)期對(duì)中性磷酸酶的活性促進(jìn)作用不明顯[29]。此外，腐植酸的施入，同樣也能改善堿性磷酸酶的活性，使難溶態(tài)磷活化并轉(zhuǎn)變?yōu)橛行B(tài)磷，加速了土壤磷循環(huán)過程。Sellhmutlu等[18]的研究則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，不同用量的腐植酸和無機(jī)肥料配合施用對(duì)堿性磷酸酶活性起到了一定程度的促進(jìn)作用，但隨著腐植酸施用量的增加，作用效果先加強(qiáng)后減弱。從改善磷酸酶活性的角度來看，腐植酸能夠適用于不同酸堿環(huán)境的土壤，并在一定用量范圍內(nèi)可以顯著增強(qiáng)土壤磷素的有效性。

1.2.4 腐植酸對(duì)土壤蔗糖酶活性的影響

蔗糖酶能促使蔗糖分解成葡萄糖和果糖，是參與土壤碳循環(huán)重要的酶。它不僅能夠表征土壤生物學(xué)活性強(qiáng)度，也能評(píng)價(jià)土壤熟化程度和土壤肥力水平[30]。通過大量試驗(yàn)分析得出，常量或減量施肥的基礎(chǔ)上增施腐植酸可明顯增強(qiáng)土壤蔗糖酶活性，并從整體表現(xiàn)來看，腐植酸復(fù)合肥處理的蔗糖酶活性高于等養(yǎng)分復(fù)合肥和不施肥處理。此外，不同用量的腐植酸對(duì)土壤蔗糖酶的活性具有不同程度的增強(qiáng)作用。并不是用量水平越高，其對(duì)酶活性作用效果越好，在一定范圍內(nèi)，蔗糖酶活性隨著腐植酸用量的增加而增強(qiáng)[36]。有研究發(fā)現(xiàn)，相比不施腐植酸的處理，腐植酸用量為60、120和300 kg/hm2蔗糖酶活性分別同比增長6.03%～27.13%、25.86%～51.87%、21.12%～38.32%，以腐植酸用量為120 kg/hm2的作用效果最好，超出120 kg/hm2反而會(huì)降低其對(duì)蔗糖酶活性的促進(jìn)作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，腐植酸的最適用量因各地區(qū)的土壤理化性質(zhì)和栽培方式的不同而有所差別，各地區(qū)要進(jìn)行田間試驗(yàn)找出相適應(yīng)的腐植酸合理用量范圍，在所限條件下充分發(fā)揮腐植酸的最大效應(yīng)。可見，適宜的施用方式和用量的腐植酸能夠顯著提高土壤蔗糖酶活性。然而，不同來源的腐植酸對(duì)土壤蔗糖酶活性的作用效果不同。風(fēng)化煤腐植酸及泥炭腐植酸均能顯著提高土壤蔗糖酶的活性，且風(fēng)化煤腐植酸對(duì)蔗糖酶活性的影響更大，褐煤腐植酸對(duì)蔗糖酶活性的影響不明顯[29]。

2 腐植酸對(duì)土壤微生物及酶活性的作用機(jī)理

2.1 腐植酸對(duì)土壤微生物的作用機(jī)理

腐植酸直接影響土壤微生物的生理活動(dòng)[37]，腐植酸對(duì)微生物膜透性的增強(qiáng)作用被認(rèn)為是刺激微生物生長和代謝的原因[38]。腐植酸為兩性膠體，表面活性大，易被微生物細(xì)胞膜吸附，可通過與營養(yǎng)元素的絡(luò)合、螯合或緊密吸附，增強(qiáng)微生物對(duì)營養(yǎng)元素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，加快微生物細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)速率。

腐植酸可作為微生物體內(nèi)呼吸作用的電子受體，促進(jìn)能量的合成，進(jìn)而促進(jìn)微生物生長和繁殖[39]。有研究表明[40]，一些土壤微生物可以利用腐植酸作為有機(jī)化合物和氫的厭氧氧化電子受體，在電子傳遞過程中產(chǎn)生支持微生物生長的能量。而且微生物還原腐植酸也增強(qiáng)了微生物還原其他不易反應(yīng)的電子受體的能力，如不溶性的鐵氧化物，腐植酸可以在微生物和鐵氧化物之間傳遞電子。

此外，腐植酸還可以通過改良土壤結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和營養(yǎng)狀況來間接影響微生物。①腐植酸為土壤微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源。土壤微生物營養(yǎng)主要包括碳、氧、氮等大量元素以及一些礦質(zhì)元素。腐植酸具有吸附、絡(luò)合、螯合、離子交換和氧化還原功能，能將NH3-N吸收固定轉(zhuǎn)化為有效的NH4

+-N，N2O轉(zhuǎn)化為NO3-，可減少土壤氮素以NH3-N和N2Ox形態(tài)的揮發(fā)損失；腐植酸與Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+等金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，減少或避免它們對(duì)磷的固定作用[41]，也可與難溶性中微量元素發(fā)生螯合反應(yīng)，生成溶解度好且易被微生物吸收的腐植酸與微量元素螯合物[42]，能將土壤中難溶性磷、鉀、中微量元素轉(zhuǎn)化為有效態(tài)養(yǎng)分，提高土壤中無效態(tài)養(yǎng)分的有效性[43]，從而為土壤微生物提供更充足的營養(yǎng)。此外，腐植酸含有碳、氫、氧等元素，在分解過程中這些元素釋放出來為土壤微生物提供碳源和氮源，供微生物生長和繁殖。②腐植酸為土壤微生物提供了適宜的生存環(huán)境。土壤微生物生存需要適宜的溫度、水分、pH及通氣狀況等。腐植酸中活性官能團(tuán)羥基、羧基可與土壤中二價(jià)離子（如Ca2+）發(fā)生凝聚反應(yīng)，再經(jīng)過植物根系的生理作用促進(jìn)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成[44]，使土壤中分散的顆粒膠連在一起，有效降低土壤容重、增加土壤孔隙度和持水量，改善土壤團(tuán)聚體的穩(wěn)定性和大團(tuán)聚體的微觀結(jié)構(gòu)[45]，從而優(yōu)化土壤中的液相、氣相物質(zhì)及土壤熱狀況[42]。此外，腐植酸分子結(jié)構(gòu)中含有羥基和酚羥基等弱酸性官能團(tuán)，使其具有良好的緩沖性能，腐植酸與其鹽類形成一套緩沖體系，以此來調(diào)節(jié)和穩(wěn)定土壤pH，從而促進(jìn)土壤微生物的繁殖和活動(dòng)，增加土壤微生物的數(shù)量和種類。

總的來說，凡是土層深厚、質(zhì)地疏松、理化性質(zhì)優(yōu)良、有效養(yǎng)分含量較高的土壤中微生物量比較高[46]。腐植酸不僅有效地改善了土壤的結(jié)構(gòu)特性，而且儲(chǔ)存和提供了豐富的有益元素和活性因子[47]，腐植酸是土壤肥力的核心物質(zhì)，對(duì)微生物具有明顯促進(jìn)作用。

2.2 腐植酸對(duì)酶活性的作用機(jī)理

眾所周知，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中腐植酸常常被用作脲酶抑制劑。而腐植酸之所以能夠抑制脲酶活性，一方面腐植酸中大量不飽和化學(xué)鍵具有提高土壤抗氧化的能力，可以有效避免脲酶的生物活性官能團(tuán)-巰基（–SH）被氧化，另一方面腐植酸還能螯合Cu2+和Hg2+，這2種重金屬是常見的土壤脲酶巰基的抑制劑[48]，它們與巰基結(jié)合后，使脲酶活性中心的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[49]，最終使脲酶的活性受到抑制。近期相關(guān)研究認(rèn)為，脲酶活性位點(diǎn)通道的開啟和關(guān)閉是由2個(gè)半胱氨酸殘基（αCys322）負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)，αCys322可以調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)的底物和產(chǎn)物通過活性中心通道。αCys322的巰基基團(tuán)可以與苯醌或鄰苯二酚進(jìn)行加成反應(yīng)形成共價(jià)化合物，從而阻斷脲酶活性，由于腐植酸中含有醌基和酚羥基，當(dāng)腐植酸添加到脲酶中時(shí)，腐植酸中的醌基或酚羥基與脲酶αCys322上的巰基基團(tuán)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，形成脲酶-腐植酸絡(luò)合物，由于產(chǎn)物粒徑較大，共價(jià)絡(luò)合物可能形成空間位阻封閉活性部位通道的入口，從而抑制脲酶的活性[50]。

土壤蔗糖酶主要來源于植物根系分泌物，腐植酸能夠提高土壤蔗糖酶活性，恰恰是因?yàn)楦菜崾┤胪寥乐?，?duì)植物根系產(chǎn)生一定的刺激作用，進(jìn)而提高根系的生理活性，增強(qiáng)其分泌物質(zhì)的能力，使得進(jìn)入到土壤中的蔗糖酶的量大大增加。隨后腐植酸和蔗糖酶形成了酶-腐植酸復(fù)合體，酶結(jié)構(gòu)得到穩(wěn)定，從而活性得以提高[51]。

土壤磷酸酶活性與土壤腐殖質(zhì)的含量呈正相關(guān)。腐植酸作為土壤腐殖質(zhì)的重要組分，必然增加土壤中腐殖質(zhì)含量，相應(yīng)地也能提高土壤磷酸酶的活性；此外，土壤中的磷酸酶也是來源于植物根系和微生物的分泌物，腐植酸能夠顯著增強(qiáng)植物和土壤微生物向外分泌多種有機(jī)物質(zhì)和酶類的能力[52]。所以說腐植酸對(duì)磷酸酶活性具有促進(jìn)作用。

除此之外，腐植酸對(duì)植物根系的刺激作用促使植物根系中三磷酸腺苷酶（ATP酶）相關(guān)基因的表達(dá)，腐植酸能夠促進(jìn)作物根系中H+-ATP酶編碼基因亞型MNA2的表達(dá)，能夠作為質(zhì)膜上H+-ATP酶誘導(dǎo)因子提高細(xì)胞活性，誘導(dǎo)質(zhì)膜表面H+-ATP酶數(shù)量的增加；同時(shí)，H+-ATP酶活性的增加也使電化學(xué)質(zhì)子梯度增加，從而影響酶的活性[53]。腐植酸也能夠?qū)ν寥乐衅渌傅幕钚援a(chǎn)生影響。有研究認(rèn)為，腐植酸與葡萄糖苷酶之間通過復(fù)合或者共價(jià)鍵結(jié)合的方式形成穩(wěn)定的復(fù)合物，改變了酶的構(gòu)象或阻礙底物與酶活性位點(diǎn)的結(jié)合，從而導(dǎo)致了酶活性的下降[54]。腐植酸施入土壤對(duì)酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和無規(guī)則卷曲影響較小[55]，不會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)。

總體而言，腐植酸與酶相互作用對(duì)酶的活性與穩(wěn)定性均有保護(hù)作用，而腐植酸對(duì)植物根系的刺激作用也是影響許多酶活性的重要原因。

3 研究展望

（1）不同種類的腐植酸對(duì)微生物和酶活性的具體影響效果和作用時(shí)期沒有準(zhǔn)確的試驗(yàn)驗(yàn)證，可以針對(duì)該方面進(jìn)一步研究，以期精確調(diào)控腐植酸對(duì)微生物和酶活性的影響，使腐植酸肥料利用率達(dá)到最大化，并在最佳的時(shí)間發(fā)揮其作用。

（2）雖然已有試驗(yàn)證明，等碳的條件下，不同來源的腐植酸處理對(duì)中性磷酸酶活性的促進(jìn)作用存在一定差異，但并未說明對(duì)酶活性促進(jìn)程度的具體值，不同用量的腐植酸對(duì)酶活性的影響也未有報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

（3）同種腐植酸肥料在施用濃度和施用時(shí)間不同時(shí)，對(duì)微生物和酶活性的影響效果及作用機(jī)制有待深入研究。

（4）同種腐植酸施入理化性質(zhì)不同的土壤中，對(duì)微生物和酶活性的影響效果是否一致，對(duì)指導(dǎo)不同地區(qū)施用腐植酸具有重要意義，值得深入研究。

（5）腐植酸結(jié)構(gòu)對(duì)微生物和酶活性影響的作用機(jī)理還需完善，腐植酸結(jié)構(gòu)對(duì)微生物生長、蔗糖酶、磷酸酶的作用機(jī)理仍然需要進(jìn)行深入研究，以期更好地利用腐植酸改善土壤狀況，提高土壤質(zhì)量。