對(duì)新型冠狀病毒肺炎康復(fù)期核酸檢測(cè)陽(yáng)性的認(rèn)識(shí)

裴銀輝，張 杰（華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 0630；唐山弘慈醫(yī)院綜合內(nèi)科，河北 唐山 06300）

2019年12月，在武漢發(fā)現(xiàn)了由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染的肺炎疫情，國(guó)務(wù)院隨即將新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）納入法定傳染病。此次SARS-CoV-2是一種以前尚未在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒。2020年1月6日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所成功自臨床患者分離并培養(yǎng)出病毒，1月27日通過(guò)國(guó)家病原微生物資源庫(kù)上傳病毒電鏡照片，隨后發(fā)布了SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的引物序列和熒光探針[1]。此后，我國(guó)各版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中將核酸檢測(cè)作為診斷和解除醫(yī)學(xué)隔離的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[2]。但近段時(shí)間來(lái)，陸續(xù)有多個(gè)COVID-19患者治愈后康復(fù)期核酸檢測(cè)轉(zhuǎn)陽(yáng)的報(bào)道[3]，分析核酸轉(zhuǎn)陽(yáng)的可能原因及對(duì)策，可為后續(xù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》的修訂及疫情防控決策提供參考。

1 核酸檢測(cè)轉(zhuǎn)陽(yáng)的可能原因

1.1 實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)技術(shù)因素

國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的各版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)為咽拭子實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸檢測(cè)陽(yáng)性，出院標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)2次（至少間隔24 h）呼吸道標(biāo)本核酸檢測(cè)陰性。SARS-CoV-2屬套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）中的冠狀病毒屬（Coronavirus）。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針，選擇針對(duì)冠狀病毒屬高度保守的開(kāi)放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleoprotein，N）2個(gè)基因區(qū)域的引物擴(kuò)增冠狀病毒屬特異核酸序列。

Target 1（ORF）：

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA；熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGBHQ1-3'。

Target 2（N）：

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。

利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[4]。患者出院前（即第一階段）病毒核酸檢測(cè)陰性包括兩種情況：假陰性和真陰性。從核酸PCR檢測(cè)技術(shù)分析，出現(xiàn)假陰性的可能原因包括：①標(biāo)本采集部位不當(dāng)，如采集口咽拭子時(shí)，采集深度不夠，未采到鼻腔深處等；②標(biāo)本保存及運(yùn)送過(guò)程不當(dāng)，致使病毒RNA降解；③病毒RNA提取效率低；④核酸檢測(cè)靈敏度不夠，低拷貝量病毒核酸不能檢出；⑤部分廠家的試劑產(chǎn)品由于研發(fā)時(shí)間短，未使用已知臨床樣本進(jìn)行必要的性能測(cè)試，可能存在試劑優(yōu)化不充分以及試劑批間差異大等問(wèn)題；⑥臨床實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范操作、結(jié)果判讀和質(zhì)量控制等。由于以上原因核酸檢測(cè)顯示為陰性，但實(shí)際上患者體內(nèi)仍然有病毒的存在，如果按照診斷標(biāo)準(zhǔn)出院，就會(huì)有傳染的風(fēng)險(xiǎn)。此階段核酸檢測(cè)為真陰性的可能性是存在的，因?yàn)椋孩俳?jīng)過(guò)積極抗病毒藥物治療，患者體內(nèi)病毒不再?gòu)?fù)制；②患者免疫力發(fā)揮抗病毒作用，通過(guò)細(xì)胞免疫或體液免疫清除病毒。真陰性表明患者已治愈，同時(shí)無(wú)傳染的風(fēng)險(xiǎn)。

患者康復(fù)期（即第二階段）核酸檢測(cè)陽(yáng)性同樣包括兩種情況：假陽(yáng)性及真陽(yáng)性。出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能原因包括：①標(biāo)本RNA提取過(guò)程污染；②PCR擴(kuò)增體系配制過(guò)程發(fā)生氣溶膠污染；③盡管實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)用了雙靶標(biāo)特異擴(kuò)增及熒光探針檢測(cè)，核酸檢測(cè)的特異性得到很大提高，但同其他檢測(cè)方法一樣面臨著樣本中非特異干擾的存在[5]；④核酸檢測(cè)中用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)本中可能由于本底非特異熒光物質(zhì)的干擾而導(dǎo)致熒光信號(hào)增強(qiáng)；⑤不同批次檢測(cè)試劑、室內(nèi)質(zhì)量控制等也可能是康復(fù)期核酸檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因[6]；⑥由于PCR兩個(gè)引物擴(kuò)增的核酸序列為冠狀病毒屬特異序列，并不是SARS-CoV-2的特異序列，因此，可能會(huì)檢出同屬其他冠狀病毒的核酸而成為假陽(yáng)性。根據(jù)流行病學(xué)及臨床特點(diǎn)，中國(guó)目前不可能有這些病毒感染，故排除這種假陽(yáng)性。由上述原因造成的假陽(yáng)性結(jié)果會(huì)導(dǎo)致對(duì)康復(fù)期患者做出疾病狀態(tài)的錯(cuò)誤判斷，增加治療及防護(hù)成本。

類(lèi)似地，患者康復(fù)期檢測(cè)真陽(yáng)性的原因主要包括：①部分患者免疫功能缺陷或降低，免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)性抗體，病毒在體內(nèi)增殖而引起復(fù)發(fā)；②第一階段檢測(cè)中出現(xiàn)的假陰性結(jié)果在第二階段被正確檢測(cè)。這部分真陽(yáng)性病例體內(nèi)有病毒復(fù)制，存在傳染風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 康復(fù)期呼吸道纖毛柱狀上皮細(xì)胞排出病毒核酸片段

呼吸道氣管與支氣管管壁組織學(xué)結(jié)構(gòu)相似，由黏膜、黏膜下層和外膜組成。黏膜表面為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮組織，主要由纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、基細(xì)胞、刷細(xì)胞和彌散的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等組成。纖毛細(xì)胞呈柱狀，每個(gè)細(xì)胞游離面約有300根纖毛。纖毛由下呼吸道向上呼吸道方向快速擺動(dòng)，將呼吸道分泌的黏液物質(zhì)及附于其上的病毒、細(xì)菌及塵粒等異物推向咽部，以咳嗽的方式排出。杯狀細(xì)胞頂部胞質(zhì)內(nèi)含大量黏原顆粒，細(xì)胞分泌的黏蛋白與管壁內(nèi)腺體的分泌物在上皮表面共同構(gòu)成一道黏液性屏障，黏附吸入空氣中的異物。基細(xì)胞呈錐形，位于上皮深部，為具有增殖和分化潛能的細(xì)胞，可根據(jù)代謝需求定向分化為纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。SARS-CoV-2進(jìn)入呼吸道后，由于病毒表面特異蛋白與呼吸道上皮細(xì)胞表面受體特異結(jié)合，吸附于上皮細(xì)胞，然后通過(guò)穿入、脫殼、生物合成、組裝成熟等環(huán)節(jié)，最后由宿主細(xì)胞釋放大量子代病毒，再感染其他上皮細(xì)胞，導(dǎo)致氣管和支氣管黏膜發(fā)生慢性炎癥病變，出現(xiàn)纖毛細(xì)胞減少，上皮纖毛運(yùn)動(dòng)減弱，甚至出現(xiàn)假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮化生為復(fù)層扁平上皮，失去由下呼吸道向上呼吸道逆向擺動(dòng)排出異物的能力[7]。在COVID-19患者治療過(guò)程中，應(yīng)用正壓氧糾正因COVID-19低氧血癥所導(dǎo)致的黏液性物質(zhì)向呼吸道深部聚集現(xiàn)象，同時(shí)急性期呼吸道上皮細(xì)胞由于受病毒感染引起嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致堆積在呼吸道被黏液黏附的病毒及核酸片段無(wú)法及時(shí)排出[8]。這一現(xiàn)象從近日開(kāi)展的COVID-19患者尸體解剖中肺部切片呈現(xiàn)大量黏液性分泌物得到進(jìn)一步的證實(shí)[9]。盡管通過(guò)治療及患者自身免疫功能的恢復(fù)，患者臨床癥狀得到有效控制，肺部炎癥改變吸收，但氣管上皮細(xì)胞組織及功能的恢復(fù)需要一定時(shí)間，由纖毛逆向擺動(dòng)至咽部的功能無(wú)法發(fā)揮，因此部分滯留在下呼吸道的病毒或病毒核酸片段無(wú)法通過(guò)咽拭子收集，導(dǎo)致核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性（假陰性）而達(dá)到出院及解除醫(yī)學(xué)隔離標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)患者處于康復(fù)后期，隨著氣管與支氣管組織結(jié)構(gòu)修復(fù)及功能恢復(fù)，之前滯留于呼吸道的病毒或病毒核酸片段又通過(guò)纖毛細(xì)胞的擺動(dòng)進(jìn)入咽部，咽拭子中檢測(cè)到特異核酸片段，故病毒核酸檢測(cè)呈陽(yáng)性（真陽(yáng)性）。

1.3 分泌型免疫球蛋白A（secretory IgA，sIgA）結(jié)合病毒康復(fù)期解離

人體經(jīng)呼吸道感染SARS-CoV-2后，抗原提呈細(xì)胞捕獲病毒，并在抗原提呈細(xì)胞內(nèi)加工、處理抗原，將抗原信息提呈B淋巴細(xì)胞，由B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，合成并分泌包括IgA在內(nèi)的多種免疫球蛋白[10]。IgA分為血清型和分泌型兩種，其中sIgA是呼吸道黏膜局部發(fā)揮保護(hù)作用的主要免疫球蛋白。sIgA為雙聚體，每個(gè)sIgA分子含兩個(gè)單體IgA、一個(gè)J鏈和一個(gè)分泌片。J鏈通過(guò)倒數(shù)第2位二硫鍵將2個(gè)IgA單體連接為二聚體，分泌片纏繞在IgA二聚體的結(jié)構(gòu)上使之形成穩(wěn)定連接并不易被酶解的分子，有助于sIgA在黏膜表面保持抗體活性[11]。sIgA性能穩(wěn)定，在局部濃度大，能抑制病原體和有害抗原黏附在黏膜上，阻擋其進(jìn)入體內(nèi)。同時(shí)也通過(guò)其介導(dǎo)的調(diào)理吞噬和溶解作用，構(gòu)成了黏膜的免疫防御屏障。與其他類(lèi)型免疫球蛋白相比，IgA鉸鏈區(qū)較短，因此不易被酶解破壞，其半衰期較長(zhǎng)（僅次于IgG）[12]。初次受到病毒攻擊后，從抗原提呈到免疫細(xì)胞活化并啟動(dòng)適應(yīng)性體液免疫應(yīng)答需要較長(zhǎng)時(shí)間（1～2周），合成并分泌在呼吸道黏膜表面的sIgA通過(guò)其抗原結(jié)合片段特異結(jié)合病毒表面抗原，阻止病毒侵入敏感細(xì)胞，病毒由于無(wú)法進(jìn)入宿主細(xì)胞而不能完成子代病毒增殖。在COVID-19的發(fā)展及治療過(guò)程中，隨著機(jī)體免疫功能的發(fā)揮，早期通過(guò)合成干擾素抑制病毒增殖，1周左右合成IgM，2周左右合成IgG，這些免疫球蛋白通過(guò)調(diào)理吞噬、補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)及抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)發(fā)揮抗病毒活性，同時(shí)，CD+8 CTL特異殺傷病毒感染細(xì)胞，病毒感染得到有效控制[13]。在藥物的積極治療下，病毒感染引起的組織器官損傷得以控制并逐漸恢復(fù)，臨床癥狀逐漸消退，肺部炎癥吸收，但此時(shí)，與sIgA結(jié)合的病毒尚存在于呼吸道黏膜局部，因此，部分患者此時(shí)行咽拭子檢測(cè)就未能檢測(cè)到病毒核酸，出現(xiàn)假陰性。在患者康復(fù)期，由于sIgA被酶解，與之結(jié)合的病毒（可能由于sIgA的作用病毒已失去感染性）或核酸片段釋放出來(lái)，通過(guò)呼吸道纖毛的擺動(dòng)排出，這時(shí)咽拭子中可能會(huì)含有病毒核酸或片段，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。

2 應(yīng)用其他診斷方法評(píng)估康復(fù)期核酸檢測(cè)陽(yáng)性的意義

由于核酸檢測(cè)靶點(diǎn)為SARS-CoV-2的2個(gè)冠狀病毒屬特異RNA保守序列，其關(guān)注的是病毒核酸片段而不是完整的病毒顆粒，因此，COVID-19患者出院后康復(fù)期即使檢測(cè)到病毒特異核酸片段，也無(wú)法對(duì)標(biāo)本來(lái)源者是否發(fā)生感染或具有傳染性做出準(zhǔn)確判斷，有必要結(jié)合其他診斷方法以準(zhǔn)確評(píng)估核酸檢測(cè)陽(yáng)性的意義，為診療標(biāo)準(zhǔn)修訂及疫情防控決策提供參考。有鑒于此，其他診斷手段應(yīng)著眼于明確康復(fù)期咽核酸陽(yáng)性拭子中是否存在具有感染性的完整病毒顆粒。以此為出發(fā)點(diǎn)，可以考慮對(duì)康復(fù)期核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)一步通過(guò)病毒培養(yǎng)或雙位點(diǎn)抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法進(jìn)行檢測(cè)，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。①病毒培養(yǎng)：咽拭子標(biāo)本通過(guò)抑菌處理，接種冠狀病毒敏感細(xì)胞株，觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)，并通過(guò)電鏡尋找病毒顆粒[14]。②雙位點(diǎn)抗體夾心ELISA：預(yù)制的特異性抗SARSCoV-2S蛋白抗體包被固相載體，加入咽拭子樣品后，再加酶標(biāo)記抗SARS-CoV-2N蛋白抗體，最后加底物顯色，通過(guò)酶對(duì)底物的分解程度定量檢測(cè)病毒抗原含量。前者主要用于判斷核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本中是否含感染性病毒顆粒，但操作復(fù)雜、需要較長(zhǎng)時(shí)間；后者操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，可以判斷是否含有病毒抗原。如果病毒培養(yǎng)顯示病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)，提示標(biāo)本來(lái)源者呼吸道仍存在完整的具有感染性病毒顆粒，同時(shí)具有潛在的傳染風(fēng)險(xiǎn)；如無(wú)細(xì)胞病變效應(yīng)或ELISA檢測(cè)陰性，則表明核酸檢測(cè)到的只是SARS-CoV-2核酸片段，標(biāo)本中不含完整具有感染性的病毒顆粒，提示隨訪者無(wú)傳染風(fēng)險(xiǎn)；而單一雙位點(diǎn)抗體夾心ELISA陽(yáng)性，只提示標(biāo)本中含有病毒抗原，不能確定標(biāo)本中是否含有感染性病毒顆粒。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，由于RT-PCR方法固有的局限性，患者康復(fù)期病毒核酸檢測(cè)由陰轉(zhuǎn)陽(yáng)是一個(gè)值得警惕的問(wèn)題，對(duì)COVID-19患者康復(fù)期核酸陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行病毒培養(yǎng)或雙抗體夾心ELISA檢測(cè)，可以分析康復(fù)期核酸檢測(cè)陽(yáng)性的意義，進(jìn)一步評(píng)估其應(yīng)用價(jià)值。此外，也可以為后續(xù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》的修訂及疫情管控決策提供重要參考。