一例貓耳癢螨病的診斷及螨蟲的分子鑒定

鞠 皓，吳婷婷，樊佳鵬，鄧小麗，常巧呈,2*

1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319

貓耳癢螨病是癢螨科耳癢螨屬貓耳癢螨引起的高度接觸性傳染病寄生蟲。主要寄生于貓和狗外耳道及臨近皮膚，并引起強(qiáng)烈刺激，引起中耳炎，可分泌大量棕黑色耳垢[1]。耳部的瘙癢感可導(dǎo)致患病動(dòng)物摩擦、抓撓自己的耳朵，并劇烈的搖頭，嚴(yán)重時(shí)耳廓有血腫產(chǎn)生。由于貓耳癢螨的傳染性強(qiáng)，能夠感染接觸到的動(dòng)物甚至人類，且蟲體抵抗力較強(qiáng)，能在6～8 ℃的畜舍內(nèi)存活2個(gè)月左右，在-25 ℃時(shí)經(jīng)6 h才死亡。導(dǎo)致該病在世界范圍廣泛存在，如美國(guó)、西班牙、意大利等其他國(guó)家，且該病的發(fā)病率較高，同窩貓中一只發(fā)病其它基本都可檢出耳癢螨，但致死率不高。近年來(lái)隨著人們對(duì)寵物貓、狗的養(yǎng)殖數(shù)量越來(lái)越多，致使耳癢螨病也愈發(fā)嚴(yán)重，患有螨蟲疾病的貓嚴(yán)重影響觀賞價(jià)值，給寵物主人帶來(lái)很大困擾，過(guò)去常以觀察病理變化結(jié)合鏡檢作為診斷貓、犬耳螨病的診斷依據(jù)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們不應(yīng)僅局限于鏡檢和形態(tài)學(xué)觀察，越來(lái)越多的學(xué)者和技術(shù)人員更加傾向于用更為準(zhǔn)確地標(biāo)記基因技術(shù)來(lái)診斷疾病。真核生物的線粒體cox1在細(xì)胞中含量高且序列高度保守，并在其遺傳基因中處于十分重要的作用。選擇該基因作為分子診斷對(duì)寄生蟲病進(jìn)行分析對(duì)比比較理想。本研究擬對(duì)貓耳部螨蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上進(jìn)一步應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，達(dá)到準(zhǔn)確鑒定病原目的。

1 材料與方法

1.1 背景

2020年11月上海市某寵物醫(yī)院收留一只3月齡流浪公貓，臨床檢查貓雙耳耳廓外側(cè)局部脫毛，兩側(cè)的耳道內(nèi)有大量黑褐色分泌物，雙耳均有異味，貓因瘙癢抓撓，導(dǎo)致耳部皮膚增厚發(fā)紅，其他部位未見明顯異常。同時(shí)在檢查過(guò)程中患貓敏感抗拒耳部檢查。對(duì)貓耳部刮取病料并收集分泌物進(jìn)行檢查。

1.2 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，DL-2 000 Marker、2×Tamaster Mix，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 臨床病理診斷

刮取耳部病變組織至輕微出血，將病貓外耳道的部分分泌物裝入5 mL離心管，用10 mL針頭挑取一部分將其放在載玻片上，滴一滴37 ℃的溫生理鹽水稀釋后在顯微鏡下分別用40×和100×觀察并剝離蟲體與分泌物及病變組織發(fā)現(xiàn)有螨蟲，觀察到雄蟲第3、4對(duì)足末端有吸盤，雌蟲沒有，雄蟲有兩個(gè)不發(fā)達(dá)的尾突,著重觀察，形態(tài)對(duì)比后,結(jié)合貓耳部滲出物及病理變化初步診斷為貓耳癢螨。

1.4 蟲體收集

將少量刮取的分泌物放置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，用10 mL或20 mL針頭將分泌物攪勻。在顯微鏡下觀察挑去單個(gè)蟲體,收集20～30只螨蟲裝于1.5 mL離心管中。

1.5 DNA提取

將收集的螨蟲研磨，按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA，并置-20 ℃冰箱保存，備用。

1.6 線粒體cox1序列的擴(kuò)增

應(yīng)用相關(guān)文獻(xiàn)中引物序擴(kuò)增螨蟲cox1部分序列。列擴(kuò)增目的引物序列為：上游引物5'- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G -3'和下游引物5'- TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA -3。PCR擴(kuò)增體系（總體積為25 μL）：2xTap Master Mix(Dye Plus)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 線粒體cox1測(cè)序及進(jìn)化分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNASTAR 5.0軟件分析，與GenBank現(xiàn)有的不同地區(qū)具有代表性的耳癢螨屬的cox1部分序列和癢螨科的不同屬的cox1部分序列進(jìn)行比較分析,以及對(duì)貓身上可能存在的所有螨蟲的cox1部分序列進(jìn)行分析比較。用EditSeq軟件和MEGA7.0.26軟件對(duì)本試驗(yàn)中及GenBank上相關(guān)cox1部分序列比對(duì)分析，采用分子系統(tǒng)發(fā)育分析的最大似然方法（ML）對(duì)所有可能的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算，構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原鏡檢

參考書《獸醫(yī)寄生蟲學(xué)》第九版書中對(duì)螨蟲的介紹及對(duì)螨蟲蟲體的鑒定，在低倍鏡進(jìn)行可發(fā)現(xiàn)大量不同時(shí)期螨蟲蟲體。從背部觀察雌蟲可以明顯看到三對(duì)足，看不到第四對(duì)足，第三對(duì)足上各有兩根很長(zhǎng)的毛，并且第三對(duì)足沒有吸盤，身體后半部分較為規(guī)則比雄蟲略大。從背部觀察雄蟲可以明顯看到四對(duì)足，第四對(duì)足較小，第三對(duì)足也各有兩根長(zhǎng)毛，且第三、四對(duì)足上有吸盤。幼蟲體型較成蟲小1～2倍，幼蟲沒發(fā)育出第四對(duì)足。結(jié)合患病部位和鏡下觀察，初步鑒定為貓耳癢螨。

2.2 線粒體cox1序列擴(kuò)增

提取蟲體DNA，用特異性引物擴(kuò)增貓耳癢螨部分cox1序列，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示cox1部分序列大小為700 bp左右（見圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 cox1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M DL-2000 Marker;1 cox1;2 陰性對(duì)照

2.3 貓耳癢螨與癢螨科內(nèi)其他屬cox1序列的進(jìn)化及分析

測(cè)序結(jié)果顯示獲得的cox1部分序列長(zhǎng)度為706 bp,并提交Genbank（MW350132.1）。該序列與GenBank公布的貓耳癢螨中國(guó)西安株（KP676679.1）cox1序列同源性99.69%。說(shuō)明本試驗(yàn)中擴(kuò)增的螨蟲是貓耳癢螨。以璃眼蜱為外群與癢螨科中各屬螨的線粒體cox1部分序列和貓身上存在的其他螨蟲線粒體cox1部分序列構(gòu)建進(jìn)化樹建樹。結(jié)果顯示，形成癢螨科和疥螨科兩大分支，同為癢螨科的足螨屬、耳癢螨屬等蟲體在同源性相似在同一分支上。

圖3 癢螨科與疥螨屬的cox1部分序列建樹圖

3 討論

患病貓臨床表現(xiàn)主要為精神不振，身體消瘦，四肢無(wú)力，外耳道有明顯黑色結(jié)痂物質(zhì)，這與臨床貓耳螨病的典型癥狀相同[2]。刮取耳部黑色分泌物進(jìn)行鏡下檢查發(fā)現(xiàn)分泌物中含有螨蟲與貓耳癢螨的形態(tài)學(xué)基本一致[3]。形態(tài)學(xué)觀察對(duì)體型較小、種類繁多、形態(tài)較為相似的螨蟲，準(zhǔn)確度較低，為了對(duì)該蟲體的準(zhǔn)確診斷，可以運(yùn)用分子生物學(xué)方法擴(kuò)增貓耳癢螨線粒體cox1部分序列。

線粒體cox1序列以其長(zhǎng)度適中、進(jìn)化緩慢、難發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移等優(yōu)點(diǎn)，可以被用來(lái)螨蟲鑒定及探討蟲種間及種內(nèi)親緣關(guān)系。對(duì)擴(kuò)增的該螨蟲cox1部分序列在NCBI上Nucleotide BLAST尋找與該基因相似的基因，得出本實(shí)驗(yàn)中上海貓耳癢螨線粒體cox1序列與Genback上已經(jīng)有的序列西 安 株（KP676679.1）和（ KP676678.1）同 源性均高于99.00%，且在遺傳進(jìn)化樹上與江蘇兩株（KP676679.1）和（KP676678.1）的貓耳癢螨處于同一分支，該條測(cè)序結(jié)果可以作為實(shí)驗(yàn)中螨為貓耳癢螨的有利證據(jù)，根據(jù)鏡下的形態(tài)學(xué)鑒定與分子診斷技術(shù)相結(jié)合可以更為準(zhǔn)確的確定病原蟲體，證明本實(shí)驗(yàn)中螨蟲是貓耳癢螨。與貓身上可能存在的疥螨線粒體cox1種類進(jìn)行建樹，發(fā)現(xiàn)貓耳癢螨與疥螨的同源性較低，可以用分子診斷技術(shù)準(zhǔn)確確定貓身上可能存在的螨蟲種類，其中貓身上存在其他螨的種類較多，但在Genback中上傳的有關(guān)序列較少，有待探討。

對(duì)螨蟲蟲種的準(zhǔn)確鑒定不但對(duì)科學(xué)研究具有重要意義，同時(shí)也對(duì)臨床病例的治療有指導(dǎo)作用。因?yàn)樗幬飳?duì)蟲卵沒有驅(qū)殺效果，所以治療螨蟲必須間隔一定時(shí)間再用藥一次。通常情況在不進(jìn)行蟲種鑒定的情況下一般要間隔7 d[4]。由于不同種類的螨蟲的生活史不同，尤其是蟲卵發(fā)育為幼蟲的時(shí)間不同。例如疥螨卵的發(fā)育時(shí)間一般為3～5 d，則一個(gè)治療周期至少為5 d，而耳癢螨卵的發(fā)育時(shí)間較短，一般為4 d，這對(duì)治療方案有較大的參考價(jià)值，可以不必等7 d間隔用藥，采用4 d間隔用藥極大的節(jié)約了時(shí)間，并減少了寵物的痛苦。本研究在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)貓臨床螨病進(jìn)行診斷和蟲種鑒定，最終確定該螨病的病原是貓耳癢螨，研究結(jié)果為貓螨病的治療提供了依據(jù)。