富含1-脫氧野尻霉素的家蠶品種萃華的選育方法

馬 欣 劉 萍 卜黎明 黃俊逸

(1河南省蠶業(yè)科學研究院，河南鄭州 450008； 2上海大學生命科學學院天然產物研究中心，上海 200444)

自古以來家蠶就是公認的滋補食療珍品[1]，《齊民要術》《天工開物》《神農本草》《本草綱目》《中國藥物》等都記載了家蠶的藥用價值[2]。現(xiàn)代研究表明，蠶體含有調節(jié)血糖的有效成分1-脫氧野尻霉素(Deoxynojirimycin，DNJ)[3-4]，但利用不同家蠶品種所制作的全蠶粉，其藥用、食用價值存在一定的差異[5]。施新琴[6]、沈以紅等[7]研究認為，家蠶地理系統(tǒng)和品種的不同均會影響DNJ的富集。2014年春季，河南省蠶業(yè)科學研究院在彩色繭育種材料的成分檢測中發(fā)現(xiàn)，綠色繭育種材料007富含DNJ，并經過6年11代的系統(tǒng)選育和DNJ指標檢測，選育出富含DNJ的家蠶新品種萃華。因萃華在育種選擇時不需要考慮絲質，簡化了選育過程，在生產上不需要考慮5齡后期的飼育、上蔟、采繭、收烘和繅絲等工作，節(jié)省了時間、人力、物力和財力，經濟效益比絲繭育有所提高。目前國內尚未制訂特殊用途家蠶品種的審定標準，一定程度上制約了此類品種的選育與開發(fā)?，F(xiàn)將萃華選育的有關情況報告如下，供同仁參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試親本 試驗蠶品種：育種材料007、009B、伊川3眠、黃繭，均是由河南省蠶業(yè)科學研究院經過多年系統(tǒng)選育得到的彩色繭育種素材。其中007的5齡期營養(yǎng)成分檢測發(fā)現(xiàn)富含DNJ，總黃酮含量測定高于其他彩色繭育種材料，但體質稍差，全繭量1.50 g左右；009B蠶繭顏色金黃色，伊川3眠蠶繭顏色桔紅色，黃繭蠶繭顏色黃色。對照蠶品種：菁松A和皓月A，中國農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所選育[8]，為現(xiàn)行推廣的強健好養(yǎng)家蠶品種，雜交配合力優(yōu)良。所有蠶品種均由河南省蠶業(yè)科學研究院繁育提供。

1.1.2 主要儀器設備 LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司產品；Scientz-10N型冷凍干燥機，浙江新芝生物科技股份有限公司產品；CW1-8-QA型超微粉碎機，山東煙臺慧寶設備制造有限公司產品；HWS-24型恒溫水浴鍋，上?；厶﹥x器制造有限公司產品；UV-1600PC型紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司產品；AL204型電子天平，梅特勒-托利多上海有限公司產品；3K15型離心機，德國Sigma公司產品。

1.1.3 主要試劑 乙腈、甲醇、石油醚、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、亞硝酸鈉、三氯化鋁、蒽酮、乙酸乙酯、蔗糖、蘆丁、甘氨酸、Folin酚均為分析純，購自國藥化學集團試劑有限公司；芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品；DNJ標準品，上海詩丹德標準技術服務有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 新蠶品種雜交組合的選育 (1)選育目標。選育出富含DNJ的家蠶品種，強健易繁，藥食兼用，飼育過程中具有孵化齊一、眠起齊一、食?；顫?、齡期經過短和生命力強等優(yōu)點。(2)選育經過。2014年春季，對不同繭色育種材料桑葉飼育至5齡第3天停止食桑，12 h后將家蠶冷凍干燥，然后進行DNJ含量的檢測，結果顯示綠色繭育種材料007富含DNJ(表1)。因此，以綠色繭育種材料007的雌性親本分別與現(xiàn)行蠶品種菁松A和皓月A的雄性親本雜交，獲得2個雜交組合F1代，結淡綠色蠶繭。2014年秋蠶期后代開始自交，F(xiàn)1～F4蛾區(qū)混合育，采用多卵圈混合育個體選擇技術，F(xiàn)2代出現(xiàn)繭色分離，白色繭∶淡綠色繭∶綠色繭=1∶2∶1，每代選留綠色蠶繭的雌、雄蛾各25頭，隨機交配留種，每代選擇卵量多、不良卵少、卵色基本一致、轉青齊的蛾區(qū)為收蟻蛾區(qū)，2015年春蠶期F3代繭色為淡綠色和綠色，至2017年春蠶期F7代繭色全部為綠色。F5～F8單蛾育同蛾區(qū)交配，每代飼育6區(qū)，各蛾區(qū)4齡餉食1 d后將飼育頭數(shù)調整為200頭左右，以綠色繭色為主進行蛾區(qū)選擇，確定2蛾為留種蛾區(qū)，在留種蛾區(qū)進行肉眼觀察，手觸粗選和個體稱量精選，進行單繭調查，全繭量控制在入選區(qū)平均值以上。F9～F11單蛾育，每代飼育6區(qū)，1～2齡采用薄膜全密閉育(全覆蓋)，3齡半覆蓋育，4～5齡普通育。全齡每晝夜給桑4次，按標準溫濕度飼育。飼育過程中，及時淘汰弱小蠶、遲眠蠶和遲熟蠶。以4齡起蠶蟲蛹率調查數(shù)據為主，全繭量控制在平均值以上，選取2個蛾區(qū)進行異蛾區(qū)交配，留種28蛾。至2018年春季培育出富含DNJ的中系蠶品種萃華E和富含DNJ的日系蠶品種萃華A。2個新品種的選育系譜成績如表2-3所示。將2個新品種組配成二元雜交組合萃華E×萃華A，定名為萃華。

表1 家蠶不同繭色育種材料的各有效成分含量%

表2 富含DNJ的家蠶日系品種萃華A選育系譜成績

表3 富含DNJ的家蠶中系品種萃華E選育系譜成績

1.2.2 新蠶品種雜交組合的實驗室鑒定 2018年和2019年春季在河南省蠶業(yè)科學研究院對新蠶品種二元雜交組合萃華進行了2期飼養(yǎng)鑒定，以全國現(xiàn)行春用多絲量蠶品種菁松×皓月為對照，4月30日收蟻，用電子秤稱量各品種蟻蠶1 g混合飼育，收蟻和各齡期起蠶消毒均用湖州寶成蠶業(yè)用品有限公司生產的中草藥防病一號。收蟻后的小蠶采用塑料薄膜覆蓋育，飼育溫度1～2齡期26～27 ℃，3～5齡期25 ℃。5齡食桑3 d后，拾蠶放入空匾中，停食并排除蠶糞1 d，置于-18 ℃冰柜中速凍。冷凍2 d后，取出速凍家蠶平鋪裝入低溫冷凍干燥機的干燥盤內進行冷凍干燥。干燥后置于CW1-8-QA型超微粉碎機中粉碎，粉碎后裝入干凈瓶中放入4 ℃冰箱保存，用于營養(yǎng)成分分析與檢測。

1.2.3 新蠶品種雜交組合DNJ含量的測定 參考文獻[9]的方法采用高效液相色譜熒光檢測法(HPLC法)測定樣品中DNJ的含量。稱取供試樣品粉1.0 g，按1∶280的質量比加入0.05 mol/L鹽酸溶液，于72.9 ℃恒溫水浴浸提2 h，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，重復提取2次，合并上清液，加蒸餾水定容DNJ提取液至50 mL，備用。取上述提取液10 μL，加入0.20 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 8.5)10 μL混合，再加入濃度為5 mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液20 μL，迅速混勻，30 ℃水浴反應30 min，之后加入0.10 mol/L甘氨酸10 μL，終止反應。用0.22 μm一次性滅菌過濾器過濾后用HPLC方法分析。

色譜條件：Inertsil ODS-SP色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%乙酸混合相(體積比55∶45)，流速1.0 mL/min；柱溫28 ℃；熒光檢測器激發(fā)波長254 nm，發(fā)射波長322 nm。重復3次，取平均值。

1.2.4 新蠶品種雜交組合總黃酮含量的測定 總黃酮含量的測定參考吳佳雯等[10]的方法進行測定。稱取樣品粉末約1.0 g于100 mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇40 mL浸提2 h，然后8 000 r/min離心15 min，過濾得濾液，濾渣再重復提取2次，合并濾液后真空濃縮，濃縮物用去離子水復溶至10 mL，儲存于4 ℃冰箱中備用。取0.1 mL適當稀釋過的樣品提取液于10 mL試管中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入10%三氯化鋁0.3 mL，搖勻再放置6 min，加入4%氫氧化鈉4 mL，最后用純水定容至25 mL，靜置10 min，測其510 nm波長處的吸光度。以蘆丁為對照所獲得的回歸方程為Y=0.012 37X+ 0.001 71(Y為510 nm處的吸光度，X為蘆丁濃度)，R2=0.999 95。樣品中總黃酮的含量，按照下列公式進行計算：

(X：標準曲線得出的總黃酮含量，單位為mg/mL；V：測量時樣品的體積，單位為mL；N：樣品提取液稀釋倍數(shù)；m：樣品干質量，單位為g)。

1.2.5 新蠶品種雜交組合蛋白質和脂肪含量的測定 樣品中蛋白質含量的測定參考鄧麗莉等[11]的方法測定。樣品中脂肪含量的測定參照徐澤平等[12]的方法測定。

1.2.6 新蠶品種雜交組合可溶性總糖含量的測定 樣品中可溶性總糖的提取與含量測定參照丁雪梅等[13]的方法。稱取0.1 g樣品于離心管中，加入5 mL蒸餾水沸水浴提取30 min。提取過濾液于25 mL容量瓶中，定容至刻度。吸取上清液0.5 mL，加蒸餾水至2 mL，加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑，最后加入5 mL濃硫酸，按照蔗糖的標準曲線的方法，于630 nm處測定吸光度，平行3組。利用蔗糖作為標準品，獲得的標準曲線方程為Y=0.008X-0.002(Y為630 nm處的吸光度，X為可溶性糖濃度)，其中R2=0.985。樣品中可溶性總糖含量，按照下列公式計算(其中樣品的質量按干物質記)：

(X：標準曲線得出的可溶性總糖含量，單位為μg/mL；V：提取液總體積，單位為mL；N：樣品提取液稀釋倍數(shù)；m：樣品的干質量，單位為g；0.5：測定時所用樣品的體積數(shù))。

1.2.7 數(shù)據分析 所有試驗均設置3個重復，應用數(shù)據分析軟件SPSS 22.0進行試驗數(shù)據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 萃華的實驗室鑒定成績

從表4可以看出，試驗蠶品種萃華幼蟲發(fā)育經過與對照蠶品種菁松×皓月相仿，5齡第3天蠶體干質量與菁松×皓月無顯著性差異，說明在相同飼育環(huán)境條件下，萃華接近菁松×皓月的水平。

表4 試驗蠶品種萃華的實驗室鑒定成績

2.2 萃華的各營養(yǎng)成分含量

從表5可以看出：試驗蠶品種萃華的蠶體內DNJ含量為0.750%，與對照蠶品種菁松×皓月(0.523%)相比高0.227個百分點；總黃酮含量為1.793%，與菁松×皓月(1.802%)相仿；蛋白質含量為61.00%，與菁松×皓月(78.80%)相比低17.80個百分點；脂肪含量為9.50%，與菁松×皓月(12.30%)相比低2.80個百分點；可溶性總糖含量達到8.20%，比菁松×皓月(5.00%)高3.20個百分點。

表5 試驗蠶品種萃華的各有效成分含量%

2.3 萃華原種及雜交組合的主要性狀

2.3.1 萃華E原種性狀 中國種系統(tǒng)，繭色綠色，孵化齊一，壯蠶素蠶，體色青黃，腹足泛綠，春季幼蟲5齡第3天冷凍干燥，DNJ含量為0.683%，5齡經過8 d 6 h，全齡經過24 d，4齡起蠶蟲蛹率98.04%。

2.3.2 萃華A原種性狀 日本種系統(tǒng)，繭色綠色，孵化齊一，壯蠶普斑，體色青黃，腹足泛綠，春季幼蟲5齡第3天冷凍干燥，DNJ含量為0.763%，5齡經過8 d 6 h，全齡經過23 d 12 h，4齡起蠶蟲蛹率96.40%。

2.3.3 萃華雜交組合性狀 二元雜交組合，卵色呈灰綠色，卵殼呈淡黃色，克卵粒數(shù)1 750粒左右，克蟻頭數(shù)2 100頭左右。孵化齊一，易于繁育。飼育過程中眠起齊一，食桑較旺，體質強健。5齡幼蟲普斑，蠶體粗壯，腹足呈半透明淡綠色。催青經過11 d，全齡經過22～23 d，全繭量1.66～1.76 g，4齡起蠶蟲蛹率94.31%～96.89%，幼蟲5齡期總黃酮含量高，富含DNJ。

3 小結與討論

DNJ是一種天然呱啶生物堿，最早由YOHJI從桑根和桑枝中分離獲得[14]。賀偉強等[14]測定桑葉中DNJ含量為0.110 0%，家蠶以桑葉為飼料，其DNJ含量為0.448 0%，是桑葉中DNJ含量的4倍多，具有積累或合成DNJ的生理機能。何行健等[15]測定oex黃血高度油蠶全蠶粉中DNJ的含量為0.482 5%，略高于對照蠶品種皓月A的0.446 5%。朱紅等[16]研究表明,全蠶粉含DNJ的質量分數(shù)為0.523 2%,是桑葉中DNJ含量的4倍多。由此分析：DNJ來源于桑葉，家蠶體內能富集DNJ；而且品種間富集DNJ的能力存在一定的差異，本次試驗也發(fā)現(xiàn)在彩色繭育種材料中綠色繭品種007的DNJ含量較高，說明通過品種改良能提高DNJ在家蠶體內的富集。

在彩色繭品種中，綠色繭品種家蠶體內的總黃酮含量較高，本次試驗也表明育種材料007的蠶體內總黃酮的含量達到2.385%，明顯高于金黃色繭品種009B(1.279%)和黃繭品種(1.576%)。賀偉強等[14]研究黃酮類化合物是一類小分子的天然活性物質，具有降血糖、消除氧自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、保肝、保護心腦血管系統(tǒng)、抗病毒等生理活性，并且毒副作用小。陳智毅等[17]研究表明，蠶體粗蛋白質含量(干物)達60.87%，高于牛奶(29.41%)和雞蛋(52.48%)，并且含有各種人體必需氨基酸，極易被人體吸收，不易引起膽固醇升高，是一種全價、優(yōu)質、完全的動物蛋白質。

綜上所述，家蠶藥食兼用，用富含DNJ的家蠶品種萃華生產全蠶粉，用于糖尿病的預防與改善，具有潛在的市場前景。