家蠶幼蟲BmMyD88基因?qū)χ嗵呛痛竽c桿菌的響應(yīng)表達(dá)

李佳璇 司徒金容 林泳儀 李樹強(qiáng) 王 濤 劉吉升

(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006)

家蠶(Bombyxmori)是由野蠶馴化，經(jīng)長期人工培育，進(jìn)化出發(fā)達(dá)的絲腺，吐出高品質(zhì)蠶絲的具有高經(jīng)濟(jì)價值的昆蟲，也是鱗翅目昆蟲的模式生物。然而，每年因蠶病造成的損失占產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的比率高達(dá)10%[1]，嚴(yán)重制約著蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。蠶病的關(guān)鍵在于致病微生物具有極強(qiáng)的感染性和致死性，一旦感染，通過普通治療方法難以起到有效作用[2]。

2004年，我國科學(xué)家率先完成家蠶全基因組的測序工作，2009年CHENG等[3]發(fā)現(xiàn)家蠶免疫相關(guān)基因218個。通過與模式生物果蠅免疫系統(tǒng)的對比分析，得到家蠶的14個Toll家族基因，以及和果蠅同源性很高的免疫缺陷(immune deficiency，Imd)基因、髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)基因、Spatzle基因及超過40余種抗微生物肽(antimicrobial peptides，AMPs)基因和抗微生物肽類基因[4-5]。

MyD88是機(jī)體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用，能調(diào)控細(xì)胞分子分泌，影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答[6]。LORD等[7]用白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)處理小鼠髓樣白血病細(xì)胞M1，發(fā)現(xiàn)髓樣分化基因家族的新成員MyD88，并克隆MyD88基因序列，認(rèn)為MyD88能夠調(diào)節(jié)髓樣細(xì)胞分化。HARDIMAN等[8]通過分析活化的樹突狀細(xì)胞及其表達(dá)序列數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)編碼人MyD88基因序列，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為33 kD，編碼296個氨基酸，具有2個特殊的結(jié)構(gòu)域，包括C端TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/L-IR domain，TIR)與N端死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)。在哺乳類動物中，MyD88基因主要表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞中，在肝、腸、脾中表達(dá)量較高。在人體中，檢測到MyD88基因主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)。

在家蠶中，BmMyD88基因在家蠶的頭部、中腸、脂肪體、絲腺、表皮中均有一定程度的表達(dá)；其中在中腸、脂肪體、表皮等主要免疫器官中的表達(dá)量較高，但整體表達(dá)水平依然很低[9]。BmMyD88是家蠶先天免疫通路上重要的接頭分子，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式類似于果蠅，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期BmTube先與BmMyD88結(jié)合形成二聚體形式，形成的二聚體恢復(fù)活性再與BmPelle蛋白結(jié)合成三聚體形式，此形式才具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，接著與活化受體識別連接，磷酸化進(jìn)入胞內(nèi)完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，機(jī)體感染革蘭氏陰性菌后會出現(xiàn)毒性反應(yīng)，其毒性主要與Lipid A結(jié)構(gòu)有關(guān)，其免疫原性由多聚糖(polysaccharide)決定[11]。脂多糖也是大腸桿菌(Escherichiacoli)細(xì)胞壁的主要成分，參與大腸桿菌引起的免疫反應(yīng)[12]。LIU等[13]研究發(fā)現(xiàn)脂多糖能夠觸發(fā)昆蟲先天免疫反應(yīng)，通過喂食或注射脂多糖可以抑制BmToll9-1在家蠶幼蟲中的表達(dá)；同時，利用脂多糖和大腸桿菌處理后，誘導(dǎo)BmToll9-2在家蠶幼蟲不同組織的表達(dá)上調(diào)，參與對脂多糖等外源病原體的識別過程[14]。

本文采用喂食法，分析脂多糖和大腸桿菌對家蠶幼蟲體內(nèi)BmMyD88基因表達(dá)的影響，從而在BmMyD88基因上揭示家蠶免疫系統(tǒng)對特定外源物質(zhì)的反應(yīng)，為家蠶感染革蘭氏陰性菌的研究提供一定的試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試?yán)ハx 本研究所使用的家蠶品系為P50，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。孵化后的幼蟲在溫度為25±1 ℃，相對濕度為60%～70%，每日上午7:00起連續(xù)12 h光照(L)之后再連續(xù)12 h黑暗(D)(L∶D=12∶12，L 7:00AM—7:00PM，D 7:00PM—7:00AM)的條件下，以新鮮桑葉飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq、DL2000 DNA Marker等試劑，均為寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(大連TaKaRa公司)產(chǎn)品；Lipopolysaccharides fromEscherichiacoliO111:B4，為西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖M，為BBI公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 T100 Thermal Cyclers PCR儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；CentrisartA-14C離心機(jī)、BSA224S電子天平，均為Sartorius公司產(chǎn)品；NanoDrop 2000超微量分光光度計、-80 ℃超低溫冰箱，均為Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 家蠶幼蟲的喂食試驗及解剖取樣 隨機(jī)選取36頭5齡第1天的家蠶幼蟲每頭單獨置于六孔板中饑餓處理24 h后進(jìn)行喂食試驗，以喂食20 μL脂多糖溶液(2.5 μg/μL)或20 μL大腸桿菌稀釋液(2.5×105個/μL)為試驗組，以喂食20 μL無菌水為對照組，共3種處理，每種處理12頭幼蟲。將不同溶液分別均勻涂抹于一片洗凈的1 cm2桑葉上，待其完全被取食后再添加新鮮桑葉繼續(xù)喂食。

在喂食前的0 h、喂食后的3 h、6 h和24 h進(jìn)行平行取樣，每頭家蠶解剖取中腸、脂肪體和表皮3種組織，保證每種溶液處理的每個時間段均有3頭家蠶重復(fù)樣品。所有樣品迅速置于無RNA酶的離心管中，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成 采用RNAiso Plus試劑盒，按其說明書提取以上組織的總RNA，并用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA的濃度和質(zhì)量，置于-80 ℃冰箱保存。

參照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit使用說明書操作，采用10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為25 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，4 ℃保存。cDNA置于-20 ℃冰箱保存，以此作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.3 目的基因的PCR擴(kuò)增 本研究所使用的PCR引物均使用Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行設(shè)計(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。檢測基因為家蠶BmMyD88基因(GenBank登錄號：XM_004921516)，內(nèi)參基因選擇家蠶BmActinA3看家基因(GenBank登錄號：NM_001126254)。

表1 BmMyD88基因擴(kuò)增和內(nèi)參基因引物

采用Taq試劑盒和20 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28次循環(huán)后，再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察試驗結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Quantity One圖像分析軟件對凝膠條帶進(jìn)行定量分析。參照軟件說明，通過校正原凝膠電泳圖的亮度和對比度，統(tǒng)一背景色調(diào)；調(diào)整目標(biāo)條帶寬度并重新編號計算；框選目的條帶后平衡條帶峰值；分析量化條帶亮度后導(dǎo)出數(shù)據(jù)。對脂多糖、大腸桿菌處理的試驗組和無菌水處理的對照組進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進(jìn)行Turkey法多重比較檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對家蠶幼蟲表皮組織中BmMyD88基因表達(dá)的影響情況

通過凝膠電泳圖分析，喂食無菌水時，家蠶幼蟲表皮組織中BmMyD88基因在4個時間段的條帶亮度相近(圖1-A)；喂食脂多糖時，家蠶幼蟲表皮組織中BmMyD88基因在6 h和24 h的條帶亮度明顯增強(qiáng)(圖1-B)；喂食大腸桿菌時，家蠶幼蟲表皮組織中BmMyD88基因在6 h的條帶最亮，24 h的條帶亮度減弱到與3 h相近(圖1-C)。通過Quantity One軟件進(jìn)一步驗證，喂食無菌水時，家蠶幼蟲表皮組織中BmMyD88基因在4個時間段的相對表達(dá)量無顯著性差異；喂食脂多糖時，家蠶幼蟲表皮組織中BmMyD88基因在6 h和24 h的相對表達(dá)量顯著上調(diào)；喂食大腸桿菌時，家蠶幼蟲表皮組織中BmMyD88基因在6 h的相對表達(dá)量最高，24 h較之前有明顯下降(圖2)。根據(jù)凝膠電泳的條帶亮度和Quality One軟件表達(dá)量分析相結(jié)合，可以判斷脂多糖和大腸桿菌均可引起B(yǎng)mMyD88基因在表皮中的表達(dá)上調(diào)；其中脂多糖的誘導(dǎo)上調(diào)作用在處理后的24 h達(dá)到最大，大腸桿菌的誘導(dǎo)上調(diào)作用在處理后的6 h達(dá)到最大。

圖1 喂食無菌水(A)、脂多糖(B)、大腸桿菌(C)后家蠶幼蟲表皮組織中BmMyD88基因的凝膠電泳

圖中數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4和圖6相同。圖2 不同喂食處理后家蠶幼蟲表皮組織中BmMyD88基因的相對表達(dá)量

2.2 不同處理對家蠶幼蟲脂肪體組織中BmMyD88基因表達(dá)的影響情況

通過凝膠電泳圖分析，喂食無菌水時，家蠶幼蟲脂肪體組織中BmMyD88基因在0 h和24 h的條帶亮度較其他2個時間段更亮(圖3-A)；喂食脂多糖時，家蠶幼蟲脂肪體組織中BmMyD88基因在3 h條帶亮度略微增強(qiáng)，6 h減弱，24 h達(dá)到最亮(圖3-B)；喂食大腸桿菌時，家蠶幼蟲脂肪體組織中BmMyD88基因在3 h的條帶最亮，6 h和24 h明顯變暗(圖3-C)。通過Quantity One軟件進(jìn)一步驗證，喂食無菌水時，家蠶幼蟲脂肪體組織中BmMyD88基因在0 h和24 h相對表達(dá)量比3 h和6 h略高，但均無顯著性差異；喂食脂多糖時，家蠶幼蟲脂肪體組織中BmMyD88基因在3 h相對表達(dá)量達(dá)到最高，6 h相對表達(dá)量較之前有所下降，但較0 h仍有增加，24 h再恢復(fù)上調(diào)；喂食大腸桿菌時，家蠶幼蟲脂肪體組織中BmMyD88基因在3 h的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，6 h和24 h基因相對表達(dá)量無顯著變化(圖4)。

圖3 喂食無菌水(A)、脂多糖(B)、大腸桿菌(C)后家蠶幼蟲脂肪體組織中BmMyD88基因的凝膠電泳

圖4 不同喂食處理后家蠶幼蟲脂肪體組織中BmMyD88基因的相對表達(dá)量

根據(jù)凝膠電泳的條帶亮度和Quality One軟件表達(dá)量分析相結(jié)合，可以判斷在脂肪體中脂多糖較大腸桿菌使BmMyD88基因上調(diào)表達(dá)的效果更好；其中脂多糖的誘導(dǎo)上調(diào)作用在處理后的24 h最為顯著。

2.3 不同處理對家蠶幼蟲中腸組織中BmMyD88基因表達(dá)的影響情況

通過凝膠電泳圖分析，喂食無菌水時，家蠶幼蟲中腸組織中BmMyD88基因在6 h的條帶最暗，其余3個時間段的條帶亮度相近(圖5-A)；喂食脂多糖和大腸桿菌時，家蠶幼蟲中腸組織中BmMyD88基因在3 h和6 h的條帶亮度明顯增強(qiáng)，24 h有明顯減弱的趨勢(圖5-B、C)。通過Quantity One軟件進(jìn)一步驗證，喂食無菌水時，家蠶幼蟲中腸組織中BmMyD88基因在6 h的相對表達(dá)量較其余3個時間段略低，但均無顯著差異；喂食脂多糖和大腸桿菌時，家蠶幼蟲中腸組織中BmMyD88基因在3 h和6 h的相對表達(dá)量明顯上調(diào)，24 h顯著下降(圖6)。

圖5 喂食無菌水(A)、脂多糖(B)、大腸桿菌(C)后家蠶幼蟲中腸組織中BmMyD88基因的凝膠電泳

圖6 不同喂食處理后家蠶幼蟲中腸組織中BmMyD88基因的相對表達(dá)量

根據(jù)凝膠電泳的條帶亮度和Quality One軟件表達(dá)量分析相結(jié)合，可以判斷脂多糖和大腸桿菌均可誘導(dǎo)家蠶幼蟲中腸組織中BmMyD88上調(diào)表達(dá)；并且最佳誘導(dǎo)上調(diào)時間均在處理后的3 h和6 h。

3 小結(jié)與討論

先天免疫對昆蟲至關(guān)重要，并且在病原體消除和傷口愈合中起著重要作用。已鑒定出幾種由病原體誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括Toll、Imd、JAK/STAT以及JNK途徑，其中Toll信號通路是昆蟲先天免疫介導(dǎo)抗菌肽合成的主要信號通路[15-16]。Toll信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，MyD88作為一種重要的接頭分子，錨定在質(zhì)膜的富含磷脂酰肌醇-4，5-雙磷酸酯的區(qū)域，在此過程中，活化的Pelle通過其激酶活性進(jìn)行自身磷酸化，釋放后磷酸化下游IkB以激活NF-kB，最終NF-kB遷移到細(xì)胞核中，誘導(dǎo)AMP和其他免疫相關(guān)基因的表達(dá)[17-20]。

為明確外源病原體能否影響B(tài)mMyD88基因的表達(dá)，本試驗對家蠶5齡幼蟲進(jìn)行脂多糖喂食，結(jié)果顯示，在表皮、脂肪體、中腸中，喂食脂多糖后BmMyD88基因表達(dá)量均能在不同時間段引起上調(diào)表達(dá)。脂多糖作為一種常見的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)可以激活無脊椎動物的先天性免疫反應(yīng)，在馬氏珍珠貝(Pinctadafucatamartensii)、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)中，脂多糖處理后MyD88基因均上調(diào)表達(dá)[21-23]。在哺乳動物中，脂多糖通過結(jié)合TLR4及MD-2(myeloid differentiation-2)形成的異二聚體[24]，誘導(dǎo)TLR4/MyD88信號通路中的炎性因子表達(dá)[25]。在家蠶中，BmTol19是最接近TLR4的Toll受體，同時ZHANG等[26]研究表明BmTol19-1-BmEsr16(Bombyxmoriecdysteroid-regulated 16 kD protein)可能具有與哺乳動物TLR4-MD-2相似的脂多糖識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，由此推測BmMyD88作為Toll通路的相關(guān)基因可能參與脂多糖引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

為進(jìn)一步驗證外源病原體對BmMyD88基因表達(dá)水平的影響，本試驗同時進(jìn)行了大腸桿菌喂食試驗，結(jié)果顯示，經(jīng)大腸桿菌處理后BmMyD88基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。CHENG等[27]早在2008年就已發(fā)現(xiàn)并鑒定家蠶Toll信號通路中Sp?tzle、Toll、MyD88、Tube等的可能成分，并指出該通路可能由大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。BmMyD88上游BmToll9-2受體基因，也能被大腸桿菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[14]。任美佳[28]研究表明家蠶中大腸桿菌處理后Tube基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。在其他無脊椎動物如三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)中也證實MyD88基因能被大腸桿菌誘導(dǎo)而使表達(dá)量增加[29]。由此可推測BmMyD88作為Toll受體的重要接頭蛋白，為保持Toll通路正常的免疫反應(yīng)，從而響應(yīng)大腸桿菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。

對比脂多糖和大腸桿菌對BmMyD88基因的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)水平，分析發(fā)現(xiàn)脂多糖和大腸桿菌均能夠引起B(yǎng)mMyD88基因的上調(diào)表達(dá)。ZHANG等[26]發(fā)現(xiàn)在家蠶幼蟲中，抗菌肽基因Moricin、CecropinB、Lebocin、Gloverin2和DefensinB均能被脂多糖和大腸桿菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。而在本試驗中脂多糖的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)速度更快、效果更強(qiáng)、時間更持久，與廖文麗等[14]研究中大腸桿菌的誘導(dǎo)BmToll9-2基因表達(dá)效果較脂多糖更好的結(jié)果相一致，推測可能由于脂多糖是細(xì)菌的細(xì)胞壁組成部分，在大腸桿菌中含有更多的脂多糖，BmMyD88基因?qū)ζ漤憫?yīng)更敏感，上調(diào)表達(dá)更顯著。

綜上所述，BmMyD88基因在家蠶5齡幼蟲的不同組織中，經(jīng)脂多糖和大腸桿菌處理后上調(diào)表達(dá)，在免疫應(yīng)答中起重要作用。含脂多糖的革蘭氏陰性菌能夠誘導(dǎo)家蠶的免疫表達(dá)反應(yīng)，且不同組織會出現(xiàn)不同程度的免疫反應(yīng)。但是，還需要進(jìn)一步通過基因敲除和過表達(dá)等手段進(jìn)行深入研究，明確BmMyD88基因在家蠶免疫系統(tǒng)對特定外源物質(zhì)的反應(yīng)及其生理功能，為完善鱗翅目昆蟲先天免疫信號通路提供數(shù)據(jù)依據(jù)。