提高牛胚胎移植效果的技術(shù)措施

佟桂芝 韓永勝 李信濤 宋斌

(1，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院 161005；2，吉林省農(nóng)科院畜牧分院 130000)

選用良種母牛通過激素的處理，使其卵巢上有多個卵泡生成（超數(shù)排卵），用優(yōu)秀的種公牛精液進行人工授精，然后將受精后的早期胚胎從子宮里取出，分別移植到多頭生理狀態(tài)相同的僅有一般生產(chǎn)性能的母牛子宮內(nèi)讓其懷孕，最后產(chǎn)出多頭優(yōu)良后代，這就是通常所說的 “借腹懷胎”。充分發(fā)揮優(yōu)良母牛的繁殖潛力；縮短時代間隔，及早進行后裔測定；誘發(fā)肉牛產(chǎn)雙胎；代替種畜的引進；保存品種資源；作為研究手段；通過胚胎移植進行奶牛品種改良；利用胚胎移植進行純種奶牛和良種肉牛擴繁。

1 供 (受) 體的選擇

1.1 供體的選擇

供體牛指的是能提供胚胎的母牛。胚胎數(shù)量與質(zhì)量是由供體牛決定。供體應(yīng)選擇健康強壯，性周期正常的個體。在對供體選擇時，首先要考慮其能否提供優(yōu)質(zhì)的卵母細胞，這樣才能獲得優(yōu)質(zhì)的早期胚胎，提高母系遺傳物質(zhì)與受體之間建立信號通路的成功率，進而提高后期著床率；青年牛的超排效果好于成母牛。

1.2 受體牛的選擇

受體牛指的是接受胚胎的母牛。影響胚胎移植效果的因素包括受體年齡、同期發(fā)情處理方法、營養(yǎng)狀況、黃體酮水平及黃體質(zhì)量等。排除有遺傳疾病牛；淘汰有生殖疾病的受體母牛，如子宮內(nèi)膜炎、卵巢囊腫、子宮頸畸形等；淘汰過胖或過瘦的牛。購買的受體牛做進一步獸醫(yī)檢查，凈化子宮，加強飼養(yǎng)管理，檢查生理狀況，受體牛同期化處理。

2 同期發(fā)情

（1）一次前列腺素法：對處于發(fā)情周期第10 天左右的供、受體牛一次肌肉注射氯前列烯醇 2～4ml（0.32～0.64mg，按牛體重大小）誘導(dǎo)發(fā)情。

（2）二次前列腺素法：注射一次氯前列烯醇 2～4ml 后 11d左右再次肌注氯前列烯醇2～4m1。

（3）陰道栓加前列腺素（CIDR+PG）法：在任意 1d 放入含有黃體酮的陰道栓，10d 左右取出陰道栓，同時肌注4ml 氯前列烯醇。

3 超數(shù)排卵

3.1 影響超數(shù)排卵的效果的因素

（1）排卵季節(jié)，最好選擇在秋冬季節(jié)。

（2）選擇 2～6 胎的供體母牛。

（3）一般最合適的時期在發(fā)情期后的第10～12 天。

（4）正確使用生殖激素處理超排母牛。

（5）進行 2 次輸精，每次使用 2～3 劑的精子。在超速排卵時要嚴格按照正規(guī)規(guī)則操作。

3.2 人工授精

（1）動作溫和，不要過于用力。

（2）輸精過程可分為兩步。先將輸精槍送到子宮頸口，第二步將子宮頸套在輸精槍上。

（3）通過子宮頸后將精液釋放在子宮體內(nèi)。

（4）操作過程中不要著急。

4 胚胎采集

沖胚一般在輸精后6～7d 進行。

（1）牛麻醉要合適，用2%普魯卡因或利多卡因 5ml，在薦椎與第一尾椎結(jié)合處或第一尾椎與第二尾椎結(jié)合處施行硬膜外腔麻醉，以防止子宮頸緊縮及母牛努責(zé)不安。

（2）洗凈外陰部并用酒精消毒。

（3）用擴張棒擴張子宮頸，用黏液抽吸棒抽吸子宮頸黏液。

（4）通過直腸把握法，將沖胚管的前端送達子宮角前1/3處。向子宮角注入沖胚液，每次 20～50ml，沖洗 5～6 次，沖胚液收集在集卵杯內(nèi)。為充分回收沖胚液，在最后1～2 次時可在直腸內(nèi)輕輕按摩子宮角。最后一次注入沖胚液的同時注入適量空氣有利于液體排空。

（5）兩側(cè)子宮角沖完后將空氣放掉，把沖卵管抽回至子宮體，直接從沖卵管灌注稀釋好的抗生素和前列腺素，拔出沖胚管。

5 胚胎撿出

將培養(yǎng)皿放置在體視顯微鏡下，用玻璃棒清除胚胎外圍的黏液雜質(zhì)，將胚胎移至另一個培養(yǎng)皿內(nèi)保存。用吸胚管先吸入少許清洗液，再吸入胚胎，在培養(yǎng)滴的不同位置沖洗胚胎3～5次，對檢出的胚胎按級別和標準加以評級。方法是將培養(yǎng)皿靜置5～10min，待胚胎沉底后，在實體顯微鏡下先用低倍鏡下檢查胚胎數(shù)量，再用高倍鏡觀察胚胎質(zhì)量。最后裝管進行鮮胚移植或冷凍保存。

6 胚胎鑒定

正常發(fā)育胚胎透明帶完整，形態(tài)規(guī)則，色調(diào)均勻一致，透明度適中.根據(jù)胚胎發(fā)育階段及發(fā)育狀況劃分，胚胎質(zhì)量分為A、B、C 和 D4 個等級。只有 A、B 級胚胎可用于胚胎切割。

7 胚胎分割

牛胚胎分割技術(shù)是在牛胚胎移植技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，牛胚胎分割技術(shù)是增加胚胎數(shù)目和生產(chǎn)同卵雙胎或多胎、獲得更多牛犢、擴大優(yōu)良畜種繁殖后代縮短育種間隔的有效方法。該技術(shù)對牛育種、選種及其遺傳疾病的早期診斷均具有十分重要的意義。奶牛胚胎移植時，為了增加奶牛受孕率，通常需要移植兩枚胚胎，但如果移植的兩枚胚胎性別不同，可能出現(xiàn)不育母犢的情況，造成一定損失。

（1）不同發(fā)育階段的胚胎分割方法不相同。處于2 一細胞到8 一細胞期胚胎，采用機械法和酶輔助機械法卵裂球分離方式。分割桑葚胚和囊胚，利用玻璃針的分割法，將胚胎內(nèi)細胞團均勻分割。可利用80 或者100 倍的顯微鏡采用徒手分割法。

（2）分割后的胚胎經(jīng)過體外培養(yǎng)或體內(nèi)培養(yǎng)，細胞數(shù)增加后，再移植可以提高妊娠率。

8 胚胎移植

移植胚胎一般在發(fā)情后第6～7 天。移植前用2%普魯卡因或利多卡因5ml，在薦椎與第一尾椎結(jié)合處或第一尾椎與第二尾椎結(jié)合處施行硬膜外腔麻醉，防止子宮頸緊縮及母牛努責(zé)不安。將裝有胚胎的吸管裝入移植槍內(nèi)，用直腸把握法通過子宮頸插入子宮角深部，注入胚胎。應(yīng)將胚胎移植到有黃體一側(cè)子宮角的上1/3～1/2 處，如有可能越深越好。要求操作人員在短時間內(nèi)將胚胎移植到位，移植凍胚原則上不超過10min。

胚胎分割移植技術(shù)是繼胚胎移植后的一次技術(shù)創(chuàng)新，它提高了良種母畜的繁殖率，縮短了育種工作中的世代間隔。加速了良種化進程，具有巨大的發(fā)展前景。