快速檢測(cè)豬血凝性腦脊髓炎病毒方法的建立

張英俊

(遼寧何氏醫(yī)學(xué)院 110163)

豬血凝性腦脊髓炎被稱為豬的急性傳染疾病，主要發(fā)病原因是感染血凝性腦脊髓炎病毒，呈現(xiàn)節(jié)段混亂的單股正鏈接RNA 病毒模式[1]。此病往往是隱性感染，且患病豬表現(xiàn)出嘔吐和消瘦的癥狀，存在較高的死亡率。一般來(lái)講，抗生素類藥物可以治療此種疾病，但實(shí)際治療要圍繞預(yù)防展開。目前檢驗(yàn)此種病毒的方式為血凝抑制試驗(yàn)和病毒分離檢測(cè)等，需要大量時(shí)間和精力支撐。本次研究的目標(biāo)是迅速建立RT-PCR 方法，快速檢測(cè)豬血凝性腦脊髓炎病毒。

1 資料和方法

1.1 一般資料

（1）病毒與細(xì)胞：豬血凝性腦脊髓炎病毒 (HEV-67N)、豬環(huán)曲病毒、豬博卡病毒、HRT-18 細(xì)胞。

（2）試驗(yàn)試劑：RNA 提取需求的產(chǎn)品、禽源反轉(zhuǎn)錄酶AMV、RNA 酶抑制酶產(chǎn)品、Taq 酶和 DL2000DNAMarker 等生物學(xué)試劑。

1.2 方法

（1）引物合成。按照結(jié)合 GenBank 中 HEV 涉及的 HE 基因以及S 基因設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，選擇保守區(qū)域，借助 DNASTAR軟件檢驗(yàn)一對(duì)引物的可靠性。其中上游引物-GTTTGGCCTCTTTTTCCTTTTG-3’；下游引物-TTCAGAGCTAATAGATGGCACACC-3’；可以擴(kuò)展的 322bp 序列，把引物稀釋處理，轉(zhuǎn)變?yōu)?25pmol/μL，保存在-20℃的環(huán)境中。

（2）特異性試驗(yàn)與多重敏感性試驗(yàn)。提取豬環(huán)曲病毒、豬博卡病毒，對(duì)其引物加以PCR 擴(kuò)增處理，將豬血凝性腦脊髓炎病毒 (HEV-67N) 的總RNA 對(duì)應(yīng)的cDNA 視作模板，檢驗(yàn)引物特異性。最后使用 HEV 病毒液依據(jù) 10 的倍數(shù)完成倍比稀釋[2]，和長(zhǎng)滿單層的 HRT-18 細(xì)胞進(jìn)行接種，72h 后按照細(xì)胞病變的數(shù)量，基于GenBank 法檢驗(yàn)病毒中涉及的TCID50 指標(biāo)。在含有 1TCID50/100μL、10TCID50/100μL、100TCID50/100μL、1000TCID50/100μL 的稀釋液中提取 200μL，檢驗(yàn) RNA,了解敏感性。

2 結(jié)果

（1）經(jīng)過(guò)觀察，HEV 擴(kuò)增 322bp 目的條帶，但缺少特異性條帶，表明引物存在一定的特異性，并且RT-PCR 方法可行。將豬血凝性腦脊髓炎病毒 (HEV-67N) 的總RNA 對(duì)應(yīng)的cDNA視作陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果是除了陽(yáng)性對(duì)照之外，其他泳道中沒(méi)有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，充分說(shuō)明引物存在較強(qiáng)的特異性。

（2）敏感性試驗(yàn)情況。若將 HEV 數(shù)值保持最低，可以檢測(cè)到3 種引物的模板，表明RT-PCR 方法存在較強(qiáng)的敏感性，更加全面地觀察豬血凝性腦脊髓炎病毒 (HEV) 的具體存在情況，對(duì)腦部病毒的檢驗(yàn)尤為敏感。

3 討論

RT-PCR 方法是引物在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成cDNA，然后將cDNA 視作模板，擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的片段。此項(xiàng)技術(shù)比較靈敏且使用空間廣泛，尤其是作用在細(xì)胞基因的表達(dá)，細(xì)胞中存在的RNA 病毒實(shí)際含量及克隆對(duì)應(yīng)基因的cDNA 序列，不管是哪種RNA，最為關(guān)鍵的都是防止 DNA 污染[3]。本次研究中，通過(guò)DNASTAR 軟件挑選HEV 中包含的S 基因及HE 基因保守性相對(duì)完整的區(qū)域，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物，完成擴(kuò)增323bp 片段，體現(xiàn)片段存在的敏感度及特異度。按照臨床病理變化可以進(jìn)行初步判斷，但疑似此種疾病的臟器剖檢變化往往不夠顯著，且病變和偽狂犬病難以分辨，增加確診的難度。所以通過(guò)RT-PCR 方法的建立可以提高凝性腦脊髓炎的檢測(cè)效果，以病毒與細(xì)胞為主建立檢測(cè)思路，了解到腦部病毒的檢出率比較高，所以臨床要建立檢測(cè)豬血凝性腦脊髓炎病毒 (HEV) 的RT-PCR 方法，提高病毒檢測(cè)效率和正確性。