我國(guó)腐爛莖線蟲(chóng)基因型及效應(yīng)基因研究進(jìn)展

楊藝煒，常 青,劉 晨，任 平，李英梅

(陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，陜西 西安 710043)

腐爛莖線蟲(chóng)又叫甘薯莖線蟲(chóng)、馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)等，可為害90～120種植物[1～2]，包括糧食作物、中藥材、經(jīng)濟(jì)作物及雜草等[3～5]。該線蟲(chóng)最初于1937年由日本傳入我國(guó)[6]，過(guò)去一直被認(rèn)為是起絨草莖線蟲(chóng)，直至1945年，成為獨(dú)立的種[7]。丁再福于1982年首次在我國(guó)病變馬鈴薯上分離出腐爛莖線蟲(chóng)[8]，并發(fā)現(xiàn)腐爛莖線蟲(chóng)與起絨草莖線蟲(chóng)在形態(tài)上存在差別，即起絨草莖線蟲(chóng)有4條側(cè)線，而腐爛莖線蟲(chóng)有6條側(cè)線[9]。該線蟲(chóng)危害甘薯和馬鈴薯的整個(gè)生育期及貯藏期，嚴(yán)重時(shí)基本絕產(chǎn)[10]。

而了解腐爛莖線蟲(chóng)的致病機(jī)理是后期防治腐爛莖線蟲(chóng)的科學(xué)基礎(chǔ)，筆者主要從腐爛莖線蟲(chóng)基因型以及與作物互作的角度，介紹該線蟲(chóng)的研究進(jìn)展，以期為腐爛莖線蟲(chóng)的學(xué)科發(fā)展提供強(qiáng)大動(dòng)力。

1 我國(guó)腐爛莖線蟲(chóng)基因型及鑒定方法

國(guó)內(nèi)外近些年關(guān)于腐爛莖線蟲(chóng)的報(bào)道表明，腐爛莖線蟲(chóng)存在明顯的種群分化。不同種群在形態(tài)學(xué)、基因型、抗藥性、致病力等方面差異顯著，腐爛莖線蟲(chóng)不能像起絨草莖線蟲(chóng)那樣根據(jù)不同的致病力而劃分出多個(gè)生理小種。Subbotin,Jeszke等將世界范圍內(nèi)不同寄主上的腐爛莖線蟲(chóng)分為7個(gè)基因型，分別是A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型[11～12]。張淑玲等首次在黑龍江地區(qū)發(fā)現(xiàn)腐爛莖線蟲(chóng)為害馬鈴薯，且鑒定結(jié)果為C型和D型[13]。張淑玲研究表明甘肅省不同區(qū)域的當(dāng)歸群體和黨參群體包含A、C、F三種基因型[14]。線蟲(chóng)在不同寄主上表現(xiàn)不同程度的分化現(xiàn)象，同一寄主不同地理群體間也存在分化現(xiàn)象。王宏寶將不同群體的A、B型腐爛莖線蟲(chóng)進(jìn)行雜交，結(jié)果表明大部分組合雜交不成功，少數(shù)雜交成功的組合F1代數(shù)量較少，幼蟲(chóng)死亡率較高[15]。說(shuō)明我國(guó)腐爛莖線蟲(chóng)遺傳差異較大，且兩個(gè)基因型間生殖隔離現(xiàn)象嚴(yán)重。

目前我國(guó)的腐爛莖線蟲(chóng)有5個(gè)基因型，但主要為A、B兩個(gè)基因型。2006年，季鐳等采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的7個(gè)腐爛莖線蟲(chóng)群體進(jìn)行了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (RFLP)，發(fā)現(xiàn)不同群體間存在基因分化現(xiàn)象[16]。2007年，繼續(xù)對(duì)該7種不同地理種群的腐爛莖線蟲(chóng)進(jìn)行ITS區(qū)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其明顯分為兩個(gè)分支，即A型(約800 bp)和B型(約1000 bp)[17]。2007年，章淑玲等研究表明我國(guó)甘薯莖線蟲(chóng)ITS1區(qū)存在L型 (466 bp) 和S型 (288 bp) 2種基因型[18]。2008年，宛菲等利用通用引物對(duì)國(guó)內(nèi)21個(gè)腐爛莖線蟲(chóng)群體進(jìn)行ITS序列分析，將兩個(gè)基因型正式命名為A型(940 bp)和B型(1100 bp)。并篩選出A型和B型腐爛莖線蟲(chóng)2對(duì)特異性引物DdS1/ DdS2和DdL1/ DdL2[19]。2008年，黃健等通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)13個(gè)腐爛莖線蟲(chóng)群體進(jìn)行ITS1區(qū)的RFLP圖譜和序列比對(duì)，并對(duì)4個(gè)腐爛莖線蟲(chóng)群體進(jìn)行形態(tài)計(jì)測(cè)，結(jié)果均表明中國(guó)的腐爛莖線蟲(chóng)群體存在兩種基因型。兩個(gè)基因型除在4個(gè)形態(tài)測(cè)計(jì)值c值、尾長(zhǎng)、V值和V'值存在顯著差異外，在其他形態(tài)測(cè)計(jì)值上并無(wú)顯著區(qū)別[20]。

植物線蟲(chóng)的鑒定方法多種多樣，主要有形態(tài)學(xué)鑒定、同工酶電泳技術(shù)鑒定、線粒體DNA(mtDNA)分析、核糖體DNA(rDNA)分析、特異性引物擴(kuò)增、qPCR、效應(yīng)蛋白基因等[21]。其中rDNA分析主要包括對(duì)ITS區(qū)、18SrDNA基因、28SrDNA基因分析。綜合多位學(xué)者研究來(lái)看，目前對(duì)于腐爛莖線蟲(chóng)的鑒定主要采用形態(tài)學(xué)鑒定、PCR-RFLP、rDNA-ITS-RFLP、特異引物擴(kuò)增PCR等手段。

2 腐爛莖線蟲(chóng)的培養(yǎng)方法

為了更深入全面地研究腐爛莖線蟲(chóng)，試驗(yàn)需要大量的蟲(chóng)源，而通過(guò)田間病樣分離得到的蟲(chóng)源不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且蟲(chóng)源多不單一，多數(shù)病塊存在多種線蟲(chóng)復(fù)合侵染的現(xiàn)象。因此大量的培養(yǎng)繁殖腐爛莖線蟲(chóng)是試驗(yàn)順利開(kāi)展的重要環(huán)節(jié)。目前主要通過(guò)活體植物組織培養(yǎng)和真菌培養(yǎng)兩種方式進(jìn)行。林茂松通過(guò)在甘薯上打孔接種線蟲(chóng)懸浮液的方法培養(yǎng)腐爛莖線蟲(chóng)[22]。阮龍成功地構(gòu)建了甘薯、馬鈴薯胡蘿卜發(fā)根單寄主培養(yǎng)腐爛莖線蟲(chóng)體系，且甘薯發(fā)根優(yōu)于胡蘿卜發(fā)根繁殖腐爛莖線蟲(chóng)[23]。除此之外，腐爛莖線蟲(chóng)能在約40個(gè)屬的70多種真菌上生存繁殖，主要有葡萄孢屬(Botrytis)、鐮孢菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、青霉屬(Penicillium)等[24～25]。

徐進(jìn)軍等通過(guò)挑取500條腐爛莖線蟲(chóng)接入茄腐鐮刀菌中，于25℃培養(yǎng)4 3d，平均得到60 777條/皿[26]。徐鵬剛用4個(gè)屬的8個(gè)菌種培養(yǎng)繁殖腐爛莖線蟲(chóng)，結(jié)果表明，鐮刀菌屬的茄鐮刀菌和半裸鐮刀菌的擴(kuò)繁效果最好[27]。 李世通利用長(zhǎng)柄鏈格孢和茄腐鐮刀菌培養(yǎng)腐爛莖線蟲(chóng)，結(jié)果表明挑取20條腐爛莖線蟲(chóng)接入長(zhǎng)柄鏈格孢斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)60d，平均每管可得線蟲(chóng)26 800條，遠(yuǎn)大于茄腐鐮刀菌的每管4 853條[28]。劉斌等研究表明玉米培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌能夠很好的培養(yǎng)繁殖腐爛莖線蟲(chóng)[29]。

3 腐爛莖線蟲(chóng)效應(yīng)基因的克隆與功能分析

3.1 抑制植物免疫反應(yīng)的效應(yīng)基因

寄主植物在面對(duì)線蟲(chóng)為害時(shí)，往往會(huì)通過(guò)產(chǎn)生活性氮和活性氧來(lái)抵御侵染。線蟲(chóng)為了完成其生活史，在寄主植物防御反應(yīng)下，相應(yīng)的進(jìn)化出多種保護(hù)機(jī)制，產(chǎn)生抑制植物抗病反應(yīng)的效應(yīng)分子，如多種抗氧化酶體系。通過(guò)克隆相關(guān)酶類基因，分析其結(jié)構(gòu)和功能，為馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)的致病機(jī)理和防控提供基礎(chǔ)材料。①過(guò)氧化物還原酶(PRX)的克隆；何旭峰成功克隆了馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)2-Cys Prx基因，并得出低劑量殺蟲(chóng)劑甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和涕滅威對(duì)2-Cys Prx基因的表達(dá)量無(wú)明顯差異[30]。劉洋成功將馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)過(guò)氧化物還原酶基因Dd-PRX克隆到pET-41b載體上進(jìn)行融合表達(dá)，成功獲得最佳表達(dá)量的重組Dd-PRX可溶性蛋白，為以PRX為靶標(biāo)進(jìn)行藥物研制奠定了基礎(chǔ)[31]。②谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)的克隆；脂質(zhì)過(guò)氧化物可激活大部分寄主植物的防御體系，而GPX可通過(guò)代謝脂氫過(guò)氧化物等阻止寄主植物的防御反應(yīng)。劉洋首次克隆了馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)Gpx基因，重組Dd-GPX蛋白并表達(dá)成功，得出GPX在進(jìn)化上具有保守性，但具有的特有進(jìn)化機(jī)制能夠展現(xiàn)不同的功能[32]。

3.2 侵染過(guò)程相關(guān)效應(yīng)基因

了解線蟲(chóng)生活史中的關(guān)鍵蛋白基因并分析其功能，是研究腐爛莖線蟲(chóng)的基礎(chǔ)。①線蟲(chóng)食道腺分泌蛋白在線蟲(chóng)致病過(guò)程中起到重要作用，因此，克隆和分析分泌蛋白是了解線蟲(chóng)致病機(jī)制的關(guān)鍵。王秉宇等首次成功分離克隆出馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)類毒液過(guò)敏原蛋白Dd-vap-2基因[33]。周采文等從腐爛莖線蟲(chóng)中克隆了一個(gè)類毒液過(guò)敏原蛋白新基因Dd-vap-1，并進(jìn)行原位雜交，結(jié)果表明該基因定位在馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)亞腹食道腺，推測(cè)該基因在線蟲(chóng)侵染甘薯的早期階段起著重要作用[34]。β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶是線蟲(chóng)食道腺分泌的一類細(xì)胞壁降解酶，彭煥首次成功分離克隆出馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶Dd-eng-1b基因并進(jìn)行序列分析[35]。②乙酰膽堿是神經(jīng)突觸信號(hào)傳遞介質(zhì)，殺線劑作用原理主要在于抑制線蟲(chóng)的乙酰膽堿酯酶，從而使線蟲(chóng)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙、呼吸麻痹并最終死亡。丁中等克隆了馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)乙酰膽堿酯酶基因，Dd-ace-3，并證實(shí)線蟲(chóng)存在多個(gè)乙酰膽堿酯酶基因，這對(duì)了解乙酰膽堿酯酶的特性、明確有關(guān)殺線劑的作用機(jī)理提供了重要信息[36]。③半胱氨酸蛋白酶是線蟲(chóng)許多生理過(guò)程所必須的蛋白酶，王高峰等首次從馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)中克隆到L型半胱氨酸蛋白酶，并推測(cè)其參與植物寄生線蟲(chóng)的早期胚胎發(fā)育過(guò)程[37]。④不飽和脂肪酸是細(xì)胞生物膜的重要組成部分，并在維系細(xì)胞生物功能上起著關(guān)鍵作用，而脂肪酸去飽和酶是催化脂肪酸合成的關(guān)鍵酶類[38]。邵穎等首次克隆出馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)脂肪酸去飽和酶Dd-FAD基因，并對(duì)其功能進(jìn)行分析，豐富了腐爛莖線蟲(chóng)致病基因的基礎(chǔ)材料[39]。

3.3 具有生物活性的小肽

FMRF酰胺多肽(FLPs)是線蟲(chóng)具有調(diào)節(jié)線蟲(chóng)神經(jīng)功能的生物活性肽[40]，在線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)方面起重要作用，也是新型殺蟲(chóng)劑最具前景的藥物靶標(biāo)之一[41]。彭煥等對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)類FMRF酰胺多肽進(jìn)行基因克隆和表達(dá)定位分析，原位雜交結(jié)果表明，Dd-FLP-1在馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)的咽神經(jīng)環(huán)、后膀胱神經(jīng)節(jié)多個(gè)細(xì)胞特異表達(dá)，推測(cè)該基因主要與線蟲(chóng)的取食運(yùn)動(dòng)以及排泄功能相關(guān)[42]。

綜合近年來(lái)我國(guó)學(xué)者對(duì)腐爛莖線蟲(chóng)的研究，現(xiàn)如今在該線蟲(chóng)的培養(yǎng)和鑒定方面已經(jīng)有一套較完整的體系。同時(shí)在腐爛莖線蟲(chóng)功能基因的挖掘和研究方面也取得很大進(jìn)展，通過(guò)原位雜交等手段，對(duì)腐爛莖線蟲(chóng)分泌的效應(yīng)蛋白進(jìn)行克隆和分析，使得腐爛莖線蟲(chóng)與作物互作機(jī)理逐漸清晰明朗，并對(duì)未來(lái)關(guān)于該線蟲(chóng)相關(guān)基因的研究提供了方法和方向，為開(kāi)發(fā)高效的殺線劑提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

4 展望

雖然我國(guó)對(duì)于腐爛莖線蟲(chóng)的研究起步較晚，但是近年來(lái)取得了一些研究成果。在未來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，主要還是圍繞腐爛莖線蟲(chóng)在侵入、移動(dòng)、取食位點(diǎn)建立等過(guò)程中分泌的效應(yīng)分子進(jìn)行研究。除了致病過(guò)程中分泌的相關(guān)蛋白，還應(yīng)該包括如類毒液過(guò)敏原蛋白等抑制植物免疫反應(yīng)的相關(guān)蛋白，分支酸變位酶等調(diào)控植物激素信號(hào)的效應(yīng)蛋白，以及其他生物活性小肽，全面研究線蟲(chóng)與作物的互作機(jī)理，最終為腐爛莖線蟲(chóng)的防控提供新的作用靶標(biāo)，投入到甘薯以及馬鈴薯等的生產(chǎn)實(shí)踐中。