活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價(jià)測定法的建立

高天紅，樸晉華 ，董培智，張志偉，王婷婷

(山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原 030031)

活血通脈膠囊為水蛭經(jīng)加工制得的膠囊劑，具有破血逐瘀、活血散瘀、通經(jīng)、通脈止痛的功效。收載于《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第十七冊，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅采用茚三酮顯色反應(yīng)定性、氮測定法定量，專屬性差，且含量多少與臨床療效無關(guān)聯(lián)性，無法真正有效評價(jià)活血通脈膠囊的內(nèi)在質(zhì)量。水蛭是水蛭科動(dòng)物螞蟥WhitmaniapigraWhitman、水蛭HirudonipponicaWhitman或柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全體，可破血通經(jīng)，逐瘀消癓[1]，它能減緩纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的過程，阻止凝血酶催化的血瘀反應(yīng)，抑制凝血酶與血小板結(jié)合[2]，《中國藥典》2015年版一部采用凝血酶滴定法(Markwardt 法)對其含量進(jìn)行控制，但測定結(jié)果滴定體積小、影響因素多，可靠性和準(zhǔn)確性存在不足[3]。

瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)將瓊脂凝膠為介質(zhì)的沉淀反應(yīng)與生物活性測定方法有機(jī)結(jié)合，以纖維蛋白原為底物，大分子物質(zhì)-酶在瓊脂凝膠中擴(kuò)散與底物結(jié)合成復(fù)合物，可形成特異性沉淀環(huán)，沉淀環(huán)直徑與酶的濃度相關(guān)[4]。本文基于水蛭素的生物效應(yīng)，分別對Markwardt 法、瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)測定水蛭和活血通脈膠囊的生物效價(jià)進(jìn)行比較研究，篩選得出經(jīng)濟(jì)、簡單、精確的水蛭素生物效價(jià)測定方法，為活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價(jià)測定法的建立，提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑牛凝血酶：中國食品藥品檢定研究院，190 BP，批號：140605-200424、140605-200426；160 BP，批號：140605-201526；牛纖維蛋白原：中國食品藥品檢定研究院，98 mg可凝蛋白，批號：140607-200736；103 mg可凝蛋白，批號：140607-201740；水蛭素標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院制備，效價(jià) 13 000 ATU。瓊脂糖粉：Solarbio、上?？笊锛夹g(shù)有限公司，三羥甲基氨基甲烷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純。

1.2 藥品活血通脈膠囊：每粒裝0.25 g，山西云中制藥有限責(zé)任公司，批號：樣品1、樣品2、樣品3；水蛭(螞蟥WhitmaniapigraWhitman和柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman，清水吊干)粗粉，過三號篩，山西云中制藥有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)儀器恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科科研儀器有限公司。

1.4 供試品溶液的制備水蛭：取粉末適量，精密稱定，加 0.9%氯化鈉溶液浸提 30 min，定容。4 000 r·min-1離心 5 min，精密量取上清液并配成不同濃度的稀釋液。

活血通脈膠囊：取活血通脈膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，精密稱定，加 0.9% 氯化鈉溶液浸提30 min，定容。 4 000 r·min-1離心5 min，精密量上清液取并配成不同濃度的稀釋液。

1.5 不同抗凝血酶生物活性效價(jià)測定方法的考察

1.5.1Markwardt 法(凝血酶滴定法) 精密量取供試品溶液100 μL，加入含 0.5% 牛纖維蛋白原的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH 7.4)200 μL，置水浴(37 ± 0.5 ℃)中，緩緩滴加30 000 BP·L-1凝血酶溶液至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積并計(jì)算。同時(shí)考察不同操作人員，不同時(shí)間及不同凝血酶對結(jié)果的影響。結(jié)果見Tab 1。

1.5.2瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)[5]取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品，用 0.9% 氯化鈉溶液制成含不同凝血酶單位的溶液。瓊脂糖加水配置成2% 的溶液。纖維蛋白原用 pH 7.5的 Tris-HCl 溶液配成 0.1% 的溶液，加入 90 ℃左右的瓊脂糖溶液(1 ∶1)，倒入培養(yǎng)皿，室溫放置 30 min打孔。取供試品溶液適量與 20 000 BP·L-1標(biāo)準(zhǔn)凝血酶溶液反應(yīng) 10 min，精密量取反應(yīng)后的供試品溶液及凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液各 20 μL，分別點(diǎn)在同一平皿中，放置 37 ℃ 18 h。測量沉淀圈垂直直徑，計(jì)算沉淀圈面積，利用凝血酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品與凝血酶反應(yīng)后效價(jià)單位(BP)，得到供試品中水蛭素的效價(jià)(ATU)。

水蛭素的生物效價(jià)(ATU)=(20 000 BP·L-1-剩余凝血酶活力BP·L-1)×稀釋倍數(shù)

1.5.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Markwardt 法采用容量分析法，瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

1.6 抗凝血酶活性生物效價(jià)測定法的建立與驗(yàn)證[6-8]

1.6.1測定方法建立 按1.5方法篩選試驗(yàn)結(jié)果，選擇活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價(jià)的測定方法。

1.6.2試驗(yàn)系的考察 分別采用不同溶劑，同種溶劑不同提取方法、溫度和時(shí)間， 提取 1 g 活血通脈膠囊中的水蛭素，測定其效價(jià)。并對培養(yǎng) 8 和 18 h 的平板進(jìn)行考察。

1.6.3方法學(xué)驗(yàn)證

1.6.3.1 專屬性考察 分別制備活血通脈膠囊陰性對照樣品和空白回收樣品，按“1.6.1”試驗(yàn)方法和“1.6.2”確定的試驗(yàn)條件測定其效價(jià)。

1.6.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品加0.9% 氯化鈉溶液溶解，并稀釋成 5 000、7 500、10 000、150 000、20 000 BP·L-1的系列活力濃度，分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL 點(diǎn)樣，測量沉淀圈直徑。測定結(jié)果見Fig 1。

Fig 1 Thrombin standard curve

1.6.3.3 中間精密度考察 取供試品溶液(樣品3)，分別改變實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件(不同人員、不同時(shí)間)，按“1.6.1”試驗(yàn)方法和“1.6.2”確定的試驗(yàn)條件，測定其效價(jià)。

1.6.3.4 重復(fù)性考察 取供試品溶液(樣品3)6 份，按“1.6.1”試驗(yàn)方法和“1.6.2”確定的試驗(yàn)條件測定其效價(jià)。

1.6.3.5 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取已知含量活血通脈膠囊樣品(批號：樣品3，效價(jià)：62.403 U·g-1)，研細(xì)，稱取 6 份，(每份約0.500 g)，分別精密稱定，再精密量取水蛭素標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 ATU·L-1) 60 μL分別加入樣品中，按“1.6.1”試驗(yàn)方法和“1.6.2”確定的試驗(yàn)條件測定其效價(jià)，并計(jì)算回收率。

1.6.3.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取儲(chǔ)存于4 ℃ 下同一供試品溶液(樣品3)，分別在制備后0、24、48、72 h 點(diǎn)樣，測定其效價(jià)。

1.6.3.7 耐用性試驗(yàn) 按“1.6.1”試驗(yàn)方法分別選用進(jìn)口及國產(chǎn)瓊脂糖制備平板，在兩板相應(yīng)位置點(diǎn)同樣的樣品，觀察不同來源的瓊脂糖對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.6.4樣品測定 取3批活血通脈膠囊樣品(樣品1、樣品2、樣品3)，按1.4制備供試品溶液，按“1.6.1”試驗(yàn)方法和“1.6.2”確定的試驗(yàn)條件測定其效價(jià)，每樣品重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果

2.1 不同抗凝血酶生物活性效價(jià)測定方法的考察

2.1.1Markwardt 法(凝血酶滴定法) Tab 1結(jié)果顯示，不同批號凝血酶、不同試驗(yàn)時(shí)間及不同試驗(yàn)人員測定同批水蛭和活血通脈膠囊抗凝血酶活性，RSD分別為 15.6%、12.9%。凝固情況分為兩種：局部形成凝塊后不再凝結(jié)和全部凝結(jié)，且滴定終點(diǎn)凝塊的形成隨著搖晃的力度和速度變化而變化，終點(diǎn)不易判斷。

Tab 1 Results of Markwardt bioassay of leech and Huoxuetongmai capsule

2.1.2瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法) Tab 2結(jié)果可見，不同試驗(yàn)人員分別測定，水蛭和活血通脈膠囊抗凝血酶活性RSD分別為 3.5%、5.2%。

Tab 2 Results of fibrinogen bioassay of leech and Huoxuetongmai capsule

2.1.3不同測定方法的比較 瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)測定水蛭和活血通脈膠囊抗凝血酶生物效價(jià)的中間精密度RSD分別為3.5%、5.2%，優(yōu)于Markwardt法(RSD分別為15.6%、12.9%)。且測量指標(biāo)易于量化，更加客觀。故選擇瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)，建立活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價(jià)的測定方法。

2.2 活血通脈膠囊抗凝血酶活性生物效價(jià)測定法的建立與驗(yàn)證

2.2.1試驗(yàn)系的考察

2.2.1.1 供試品溶液處理方法的考察 試驗(yàn)結(jié)果顯示0.9% 氯化鈉溶液提取效果好于水，5 mL 和10 mL 0.9% 氯化鈉溶液提取1 g活血通脈膠囊的水蛭素含量一致，10 mL 0.9% 氯化鈉溶液超聲 30 min 提取與浸泡 30 min 提取的水蛭素含量一致，10 ℃ 冷浸30 min 提取與常溫(30 ℃)浸泡30 min 提取的水蛭素含量一致，30 min 提取液與 4 h 提取液水蛭素含量一致。

綜合考慮到經(jīng)濟(jì)、節(jié)約、效能等因素，以0.9% 氯化鈉溶液為提取試劑，以 100 g·L-1比例、常溫浸提 30 min 提取供試品中的水蛭素。

2.2.1.2 不同培養(yǎng)時(shí)間考察 培養(yǎng)8 h 形成的沉淀圈不規(guī)則、不同劑量間無明顯差別；培養(yǎng)18 h 后沉淀圈形狀規(guī)則便于測量，選擇培養(yǎng)18 h。

2.2.2方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.2.1 專屬性考察 陰性對照樣品沉淀圈大小與凝血酶標(biāo)準(zhǔn)對照一致，空白回收樣品沉淀圈與樣品一致，陰性對照樣品對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無干擾。

2.2.2.2 纖維蛋白原平板法凝血酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品活力濃度為橫坐標(biāo)，沉淀圈面積為縱坐標(biāo)計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明，凝血酶濃度5～20 BP 范圍內(nèi)，回歸方程 Y=40.9 + 4.94X，R2=0.994?？捎糜诨钛}膠囊中水蛭素效價(jià)的計(jì)算。見Fig 1。

2.2.2.3 中間精密度考察 取供試品溶液(樣品3)，分別改變實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件(不同人員、不同時(shí)間)，測定樣品中水蛭素的效價(jià)，結(jié)果中間精密度 RSD 為 3.2%。

2.2.2.4 重復(fù)性考察 供試品溶液(樣品3)6 份，測定樣品中水蛭素的效價(jià)。結(jié)果重復(fù)性考察 RSD 為4.7%。

2.2.2.5 回收率試驗(yàn) 結(jié)果見Tab 3，本法平均回收率為 98.26% (n=6)，RSD 為 2.3%。

Tab 3 Recovery test results

2.2.2.6 溶液穩(wěn)定性考察 儲(chǔ)存于4 ℃ 下供試品溶液，分別在制備后0、24、48、72 h點(diǎn)樣，測定其效價(jià)，供試品溶液在4 ℃ 下72 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2.7 耐用性 相應(yīng)位置上，使用進(jìn)口瓊脂糖的平板沉淀圈明顯小于使用國產(chǎn)瓊脂糖的平板，顯示不同來源和批號的瓊脂糖對本法測定結(jié)果有影響。

2.2.3 供試品測定Tab 4結(jié)果可見，三批供試品的效價(jià)測定結(jié)果分別為70.355、61.485、62.357 ATU·g-1；RSD分別為 5.0%、3.2%、4.7%。

Tab 4 Titer test results of three batches of samples

3 討論

水蛭始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是破血逐淤類經(jīng)典中藥。其生物活性物質(zhì)多樣，依藥理作用可大致分為兩類，一類直接作用于凝血系統(tǒng)，如水蛭素、吻蛭素、類肝素等；另一類為其他蛋白酶抑制劑組分，如Decorsin、Hementin等。具有抗凝、抗血栓、抗腫瘤、抗細(xì)胞凋亡等多種藥理作用[9]，主要成分水蛭素是已知作用最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑。纖維蛋白原在凝血酶的作用下生成纖維蛋白，繼而形成凝膠，這是血液凝固的基本過程，通過觀察藥物對凝血酶與纖維蛋白原水解反應(yīng)的影響，可以評價(jià)藥物的抗凝血酶作用。

凝血酶是在生理狀態(tài)下唯一能將大量蛋白 C(PC)轉(zhuǎn)化為 APC 的絲氨酸蛋白酶，通過裂解纖維蛋白原，形成纖維蛋白單體，活化血小板，激活抗凝系統(tǒng)蛋白 C，在凝血過程中起重要作用。水蛭素可作用于凝血酶的非活性底物識(shí)別位點(diǎn)和酶活性中心識(shí)別位點(diǎn)，1 ∶1結(jié)合形成不可逆復(fù)合物，使后者失去活性[10]。其與血漿中的游離凝血酶結(jié)合速度比纖維蛋白原快，同時(shí)可中和與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶。

目前水蛭素活性測定方法有 Markwardt 法，Chromozym TH 發(fā)色底物法，光散射法，纖維蛋白原平板法等。其中Chromozym TH 發(fā)色底物法和光散射法需配備進(jìn)口試劑及儀器設(shè)備，成本較高，不利于推廣使用。

Markwardt法是《中國藥典》2015年版水蛭的含量測定方法，利用水蛭素與凝血酶反應(yīng)速度較纖維蛋白原快，反應(yīng)呈正比關(guān)系，選用適宜的滴定濃度，終點(diǎn)時(shí)稍過量凝血酶使纖維蛋白原產(chǎn)生凝固。血液凝固是一個(gè)連續(xù)過程，初凝出現(xiàn)的微量凝膠為透明狀，肉眼難以觀察，滴定終點(diǎn)也要靠試驗(yàn)者的主觀判斷；同時(shí)有研究顯示，在滴定間隔時(shí)間和滴定時(shí)間固定的情況下，凝血酶單次滴加量不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有明顯差別[11]。本研究選用滴定濃度 30 000 BP·L-1，滴定中每隔1 min搖動(dòng)，不利于形成纖維蛋白凝膠。其滴定過程不易控制，滴定終點(diǎn)不易觀察，易受環(huán)境溫度、人員操作熟練程度等的影響。同時(shí)結(jié)果用容量分析方法進(jìn)行計(jì)算，誤差較大。該法測定的水蛭和活血通脈膠囊的抗凝血酶活性中間精密度RSD分別為 15.6%、12.9%。

瓊脂糖-纖維蛋白原平板法是將標(biāo)準(zhǔn)凝血酶及經(jīng)水蛭素1 ∶1抑制后的凝血酶滴加到瓊脂糖-纖維蛋白原平板加樣孔內(nèi)，凝血酶在擴(kuò)散過程中與纖維蛋白原形成酶-底物復(fù)合物，使纖維蛋白原水解，并發(fā)生交聯(lián)呈乳白色沉淀，在一定范圍內(nèi)沉淀圈直徑與凝血酶活性呈正相關(guān)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可經(jīng)水蛭素抑制后剩余凝血酶的量，計(jì)算水蛭素的效價(jià)[12]。其評價(jià)指標(biāo)與活血通脈膠囊功能主治相關(guān)，方法準(zhǔn)確簡便、影響因素少、易于操作，具有較好的精密度和重復(fù)性，符合中藥生物活性測定的基本原則。耐用性試驗(yàn)提示使用進(jìn)口瓊脂糖的平板沉淀圈較國產(chǎn)瓊脂糖小，考慮到采用了標(biāo)準(zhǔn)曲線法，且供試品和凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品的免疫擴(kuò)散可同時(shí)在一塊纖維蛋白原平板上進(jìn)行,有助于提高耐用性, 減少實(shí)驗(yàn)誤差。

在瓊脂糖-纖維蛋白原平板法(沉淀法)測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法的選擇中，考慮量反應(yīng)平行線法的一般原則是標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)和樣品同質(zhì)，活血通脈膠囊除水蛭素外，還包括類肝素、組織胺及多種其他蛋白酶抑制劑，從多個(gè)環(huán)節(jié)影響血液凝固、促進(jìn)纖溶，故未采用量反應(yīng)平行線法。 單點(diǎn)法測量沉淀圈直徑或面積計(jì)算效價(jià)，結(jié)果易受試劑如纖維蛋白和凝血酶、點(diǎn)樣誤差、平板制備等多種因素影響，重現(xiàn)性較差。故研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定抗凝血酶生物效價(jià)，以有效控制實(shí)驗(yàn)誤差。