基于生物信息學(xué)篩選紅景天苷對大鼠缺血/再灌注神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)基因

官喜龍，徐 靜，陳軼塵，楊 婧

(1．鷹潭市人民醫(yī)院麻醉科，江西 鷹潭 335000；2.寧波市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，浙江 寧波 315000；3．浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院麻醉科，浙江 杭州 310002)

腦卒中是最常見的心血管疾病疾病之一，87%的中風(fēng)可被歸類為缺血性腦卒中，已成為全球范圍內(nèi)的嚴(yán)重健康問題[1]。目前除溶栓治療外，針對缺血性中風(fēng)引起的神經(jīng)功能損傷尚無有效的治療手段，因此迫切需要開發(fā)用于治療腦卒中的新型藥物，對腦卒中病理過程涉及的分子機(jī)制進(jìn)行更深入的探索可能會(huì)找到對抗這種復(fù)雜疾病的新方法。紅景天苷(salidroside，Sal)是大花紅景天的主要活性成分，是一種苯丙烷類糖苷化合物，安全性高且藥理作用廣泛，包括抗氧化應(yīng)激、抗疲勞、抗炎等作用[1]。近年來有研究表明紅景天苷預(yù)處理能夠明顯減少大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的梗塞面積，預(yù)防腦水腫，改善神經(jīng)功能，其潛在分子機(jī)制涉及多種信號傳導(dǎo)途徑(如PI3K/Akt/HIF、GSK-3β/Nrf2信號通路)[2]。

微陣列技術(shù)可以快速篩選出與腦卒中相關(guān)的差異基因表達(dá)信息。結(jié)合生物信息學(xué)分析，可以分析紅景天苷預(yù)處理前后對影響腦組織缺血/再灌注的差異表達(dá)基因在腦卒中發(fā)病中的功能途徑。Lai等[3]最初在2015年的GSE52001數(shù)據(jù)集中篩選了與紅景天苷介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)的基因表達(dá)。但是該研究僅關(guān)注并研究了其中一些基因的功能。為了更全面地了解紅景天苷對抗腦缺血/再灌注損傷的發(fā)病機(jī)理，我們使用了多種生物信息學(xué)技術(shù)來重新分析GSE52001數(shù)據(jù)集中的部分?jǐn)?shù)據(jù)。這項(xiàng)工作將提供腦卒中在分子水平上病理生理學(xué)的進(jìn)一步見解，并探索新的潛在分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)來源和差異基因的篩選從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)。全基因組微陣列表達(dá)譜由Agilent GPL14746平臺提供，因?yàn)榻?jīng)過紅景天苷預(yù)處理的大鼠缺血腦組織中Egr2、Egr4和Arc等早期基因在1h的表達(dá)上調(diào)最明顯，因此本文重點(diǎn)分析了缺血腦組織和經(jīng)紅景天苷預(yù)處理1h的缺血腦組織的測序數(shù)據(jù)。根據(jù)原始數(shù)據(jù)的注釋信息，將探針轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因名。當(dāng)多個(gè)探針對應(yīng)同一個(gè)基因時(shí)，僅篩選具有最高平均表達(dá)水平的探針。使用R/Bioconductor Limma軟件包對每個(gè)實(shí)驗(yàn)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理標(biāo)準(zhǔn)化。線性模型擬合后，使用貝葉斯線性模型可以識別差異基因。P<0.05和|logFC|>1作為差異基因的截止標(biāo)準(zhǔn)。分別使用R軟件包“pheatmap”和“ggplot2”進(jìn)行熱圖和火山圖的可視化作圖。

1.2 差異基因的富集分析本項(xiàng)研究中，使用R語言對差異基因進(jìn)行了的基因本體論(gene ontology，GO)富集和《京都議定書基因與基因組百科全書》(The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)相關(guān)途徑分析。另外使用R中的“clusterProfiler”包進(jìn)行了基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，使用ggplot2包在R語言中進(jìn)行了可視化作圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和可視化以及核心基因的確定單個(gè)基因并不能調(diào)節(jié)生物學(xué)功能，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是細(xì)胞中生物學(xué)過程的主要參與者，使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)能夠找到的蛋白質(zhì)的全面信息，用于評估蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)信息。隨后，通過Cytoscape軟件(版本3.7.1)構(gòu)建并可視化了PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape中的MCODE(分子復(fù)合物檢測)插件分析來篩選PPI網(wǎng)絡(luò)的最重要模塊。選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：MCODE score ≥3, degree cutoff=2, node score cutoff=0.2 and max depth=100，使用Cytoscape軟件(版本3.7.1)構(gòu)建了可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.4 TF-DEGs-microRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將這些DEGs上傳到NetworkAnalysts，從ENCODE數(shù)據(jù)庫預(yù)測針對DEGs的TF，TarBase預(yù)測與DEGs相關(guān)的microRNA，最后在Cytoscape中建立TF-DEGs-microRNA網(wǎng)絡(luò)并將其可視化。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因?qū)⑿酒瑲w一化處理后(Fig 1A)，通過R語言的Limma軟件包計(jì)算，將P<0.05和| logFC |> 1定義為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)?？偣埠Y選出250個(gè)DEGs，包括82個(gè)上調(diào)的DEGs和168個(gè)下調(diào)的DEGs。DEGs由火山圖(Fig 1B)和熱圖(Fig 1C)展示。

2.2 差異基因的功能富集分析為了進(jìn)一步研究這些差異基因的功能，通過R語言進(jìn)行了GO術(shù)語和KEGG通路分析。這些差異基因均分為3個(gè)主要功能類別，即生物過程(biological processes，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞成分(cellular components，CC)。結(jié)果表明，這些差異基因主要參與類固醇代謝、激素代謝和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)等生物學(xué)過程(Fig 2A)。在分子功能(MF)層面，主要與受體配體活性、神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合和激素活性相關(guān)(Fig 2B)。在細(xì)胞組分(CC)分析中，DEGs主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白細(xì)胞外基質(zhì)(Fig 2C)。在KEGG數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)這些差異基因和神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路和PPAR信號通路密切相關(guān)(Fig 2D)。此外，我們對微陣列中的所有基因進(jìn)行了GSEA分析。GSEA分析的結(jié)果表明，紅景天苷預(yù)處理在大鼠腦缺血模型中主要影響了“雌激素代謝”、“脂肪酸合成”、“IL6-JAK-STAT3信號通路”以及“干擾素γ”(Fig 3A-D)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵模塊分析為了研究這些DEGs之間的蛋白質(zhì)相互作用及其參與調(diào)控的關(guān)鍵基因。在STRING(V11.0)中構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，使用軟件工具Cytoscape對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，并試用 Cytoscape中MCODE進(jìn)行的模塊分析，從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出一個(gè)最重要模塊(Fig 4)，共有20個(gè)基因。 我們發(fā)現(xiàn)Egr2、Nr4a1、Egr1和Fos與排名前十的顯著變化的差異基因重疊。

Fig 1 Gene chip quality verification and DEGs screening

2.4 TF-DEGs-microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)挑選出共同靶向microRNA和TF的DEGs，提取其相關(guān)調(diào)控因子，并導(dǎo)入至然后在Cytoscape中構(gòu)建與TF-microRNA相互作用的網(wǎng)絡(luò)(Fig 5)。我們預(yù)測到TAL1和mir-19a-3p能夠調(diào)節(jié)Nr4a1的表達(dá)。

3 討論

本項(xiàng)研究中，一共篩查出250個(gè)差異基因，包括包括82個(gè)上調(diào)的DEGs和168個(gè)下調(diào)的DEGs。對這些差異基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，確定了紅景天苷參與腦保護(hù)作用的潛在作用分子。前10個(gè)DEGs(Egr2、Arc、Cort、Egr4、LOC689064、Nr4a1、Egr1、Sik1、Fos和Tnfaip6)被認(rèn)為是紅景天苷對缺血/再灌注腦保護(hù)過程的關(guān)鍵基因。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示了差異基因之間的相互作用。網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)可能是紅景天苷在缺血/再灌注的病理過程中起關(guān)鍵作用的分子。通過對PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的各個(gè)節(jié)點(diǎn)的計(jì)算節(jié)點(diǎn)信息構(gòu)建出最重要的聚類模塊，該模塊一共有20個(gè)差異基因組成，其中有4個(gè)與前10個(gè)差異基因相同(Egr2、Nr4a1、Egr1和Fos)。

Nr4a1 (Nur77)是類固醇甲狀腺受體家族中孤核受體NR4A亞家族中的一員。目前尚未發(fā)現(xiàn)其內(nèi)源性配體，因此成為孤核受體。作為一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，Nr4a1與許多細(xì)胞內(nèi)途徑相關(guān)，如增生性疾病、代謝性疾病和癌癥等[4]。已有大量研究表明，Nr4a1參與多種疾病的病理生理過程，如腫瘤生長、炎癥反應(yīng)、脂肪形成以及血管重塑等[5]。周浩等[6]發(fā)現(xiàn)，心臟微血管缺血/再灌注損傷后Nr4a1明顯上調(diào)，并且其水平與微血管塌陷，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和線粒體損傷呈正相關(guān)。另一項(xiàng)研究表明，Nr4a1在再灌注腦組織中顯著增加，較高水平的Nr4a1能夠降低線粒體動(dòng)作電位，誘發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激，中斷ATP生成，并啟動(dòng)caspase-9依賴性細(xì)胞凋亡。并且敲除Nr4a1可減少腦梗死面積并抑制神經(jīng)元凋亡[7]。另外，小膠質(zhì)細(xì)胞中的Nr4a1作用于 NF-κB/p65信號通路促進(jìn)中樞炎癥因子的表達(dá)，從而加劇了缺血在灌注的腦損傷[8]。以上研究結(jié)果提示，Nr4a1再組織缺血/再灌注的病理過程中的關(guān)鍵分子。大量的研究支持紅景天苷對缺血/再灌注腦保護(hù)作用[9]。已知基因的功能受上游轉(zhuǎn)錄因子和下游microRNA調(diào)控，為了進(jìn)一步分析Nr4a1參與腦保護(hù)的分子機(jī)制，我們利用生物信息學(xué)技術(shù)，整合了多個(gè)數(shù)據(jù)庫，最終構(gòu)建了TF-DEGs-microRNA的協(xié)同調(diào)解網(wǎng)絡(luò)。其中Nr4a1與TAL1和mir-425-5p存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系。TAL1是一種轉(zhuǎn)錄因子，主要識別GATA的啟動(dòng)子序列。主要在紅細(xì)胞和紅細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞系中表達(dá)，目前研究認(rèn)為，TAL1可以促進(jìn)類紅細(xì)胞向紅細(xì)胞的分化[10]。miRNA是內(nèi)源性非編碼RNA，其功能是降解或抑制靶基因的翻譯過程，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。已有多項(xiàng)研究表明，抑制mir-19a-3p可缺血性/再灌注腦損傷[11]。TAL1是否能夠調(diào)控Nr4a1的表達(dá)，Nr4a1是否為mir-19a-3p的靶基因，這部分研究內(nèi)容尚處于空白狀態(tài)。因此我們的研究結(jié)果為紅景天苷在腦保護(hù)作用的研究中提供了新的思路。

Fig 2 GO enrichment analysis of DEGs and KEGG

Fig 3 GSEA analysis of all genes

Fig 4 PPI network reconstruction and key module screening

大腦缺血狀態(tài)會(huì)誘導(dǎo)某些早期基因的表達(dá)，本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注模型中能夠明顯調(diào)節(jié)幾種相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄(Egr1、Egr2、Egr4和Arc等)。有研究報(bào)道這些基因參與神經(jīng)元的突觸可塑性。早期基因Arc是神經(jīng)元突觸可塑性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與維持LTP和長期記憶的鞏固[11]，并且對突觸活性高度敏感，也可以通過突觸可塑性刺激誘導(dǎo)早起生長反應(yīng)基因Egr家族基因的表達(dá)[12]。因此，我們的數(shù)據(jù)支持紅景天苷可以通過參與Egrs和Arc來增強(qiáng)缺血性腦損傷后突觸可塑性的觀點(diǎn)。另外一項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅景天苷介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用與早期生長反應(yīng)基因(Egrs)的誘導(dǎo)有關(guān)[3]，與我們的生物信息學(xué)分析一致，并支持了我們的分析結(jié)果。

為了獲得對這些差異基因的全面理解，我們使用多種生物信息學(xué)技術(shù)分析這些差異基因。GO的生物學(xué)過程主要包括類固醇代謝、激素代謝和IL-1β的產(chǎn)生。此外KEGG富集分析表明，這些差異基因與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路和膽固醇代謝相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，在研究腦缺血后的損傷機(jī)制和預(yù)后時(shí)，類固醇都是重要的考慮因素。臨床研究表明，由于雌激素的保護(hù)作用，男性的中風(fēng)發(fā)生率顯著高于女性，且女性絕經(jīng)后的中風(fēng)發(fā)生率也遠(yuǎn)高于絕經(jīng)期。動(dòng)物研究和臨床研究一致，在缺血/再灌注模型中，雌性成年大鼠的梗死面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于雌性成年大鼠[13]。值得注意的是，糖尿病模型的大鼠對缺血的易感性也遠(yuǎn)小于對照組，因?yàn)樘悄虿〈笫蟠萍に卮x障礙，體內(nèi)雌激素水平較高[14]。以上研究表明，內(nèi)源性雌激素對腦卒中的保護(hù)作用。

除了雌激素，孕酮等類固醇激素也降低了女性中風(fēng)的發(fā)生率。另一方面，動(dòng)物研究也支持了類固醇激素的腦保護(hù)作用。孕酮治療可減少缺血性梗塞的程度并促進(jìn)愈后，其潛在的分子機(jī)制包括孕酮能夠減少血腦屏障的破壞和減輕腦水腫。腦缺血后，會(huì)出現(xiàn)急性和長期炎癥反應(yīng)，包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的早期活化，促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的合成和釋放以及嗜中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向腦實(shí)質(zhì)的浸潤。這一系列級聯(lián)反應(yīng)加速了神經(jīng)元的死亡和腦損傷的程度[15]。孕酮治療可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的密度和極化，并減少促炎性細(xì)胞因子和一氧化氮合酶產(chǎn)生。此外，孕酮治療還可以減少腦線粒體功能障礙，可增加神經(jīng)元，少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體的密度等[16]。以上研究表明了孕酮的腦保護(hù)作用且上述證據(jù)與KEGG分析相符。

為了驗(yàn)證GO和KEGG途徑富集分析的一致性，接下來對所有基因進(jìn)行了GSEA分析。分析表明，紅景天苷預(yù)處理的腦缺血模型主要影響了雌激素代謝、脂肪酸代謝和炎癥反應(yīng)和干擾素通路密切相關(guān)[17]。

Fig 5 TF-DEGs-microRNA interaction network

這項(xiàng)研究的主要目的是鑒定與紅景天苷預(yù)處理的腦缺血模型相關(guān)的候選基因，為紅景天苷的腦保護(hù)作用提供潛在的分子靶標(biāo)。通過多種生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其主要通過類固醇代謝、激素代謝和炎癥因子水平等方面發(fā)揮腦保護(hù)作用。并鑒定出紅景天苷預(yù)處理對抗腦卒中的關(guān)鍵候選基因。盡管此研究中鑒定的基因在先前的研究中得到了證實(shí)，但仍需要進(jìn)一步的研究來探索這些基因和途徑的具體調(diào)控機(jī)制。