三七對(duì)急性腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)血管單元的整體保護(hù)作用研究

梁 萍，黃 清，農(nóng)立宇，林 軍，劉 蕾，蒙蘭青,3

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院桂西地區(qū)高發(fā)病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 湛江 524000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 百色 533000)

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是由缺血缺氧性腦組織壞死導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失癥狀的一種疾病，約占全球死亡總數(shù)的11%[1]。腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是IS重要的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，涉及多個(gè)病變機(jī)制，最終導(dǎo)致神經(jīng)元等多種腦細(xì)胞凋亡、壞死[2]。 “神經(jīng)血管單元(neurovascular unit， NVU)”作為IS的整體救治模型，旨在挽救包含神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的缺血腦組織[3]。隨著醫(yī)學(xué)水平的提高和中藥整體觀的認(rèn)可，人們發(fā)現(xiàn)被譽(yù)為“人參之王”的三七(PanaxNotoginseng，PN)在CIRI治療過程發(fā)揮了較大的作用。PN是五加科人參屬草本植物，含有多種活性成分，可通過抑制CIRI后多個(gè)病理生理環(huán)節(jié)[4-5]，促進(jìn)腦缺血后NVU組分的修復(fù)[6]，發(fā)揮明顯的抗CIRI作用。但目前，三七總皂苷(PanaxNotoginsengSaponins，PNS)(PN的有效活性成分之一)在臨床中IS的治療更加常見。將PN整體活性成分用于CIRI的治療是一個(gè)新的探索。本研究中，通過觀察大鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)、腦梗死體積百分比、NVU超微結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)測(cè)定氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation and reperfusion，OGD/R)后，細(xì)胞共培養(yǎng)模型中的4 h滲漏及細(xì)胞凋亡率，進(jìn)一步評(píng)價(jià)PN對(duì)腦缺血后NVU的保護(hù)作用，也為將PN開發(fā)成一種治療IS的多靶點(diǎn)保護(hù)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD♂大鼠100只，體質(zhì)量(250±30)g，制作MCAO大鼠模型。2 ∶1雌雄比例的大鼠共15只，體質(zhì)量(300±30)g，用來(lái)繁殖新生幼鼠。大鼠均購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(湘)2014-0011。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理辦法》執(zhí)行。

1.2 藥品三七粉，購(gòu)自文山市苗鄉(xiāng)三七實(shí)業(yè)有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中國(guó)藥典》2015年版一部，產(chǎn)品批號(hào):C20180803。稱取一定量三七粉，將其用生理鹽水稀釋配成終濃度為5、10、15 g·L-1的溶液灌胃。

1.3 主要試劑與耗材4%多聚甲醛(貨號(hào)：P110)、氯化2，3，5三苯基四氮唑(TTC，貨號(hào)：G3005)、含EDTA胰蛋白酶(貨號(hào)：T1300)、不含EDTA胰蛋白酶(貨號(hào)：T1350)、10×多聚賴氨酸(貨號(hào)：P2100)、PBS(貨號(hào)：P1020)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(貨號(hào)：30710126，156499)、15 mL離心管(貨號(hào)：430790)、0.22滅菌濾器(貨號(hào)：SLGP033RB)均購(gòu)自Solarbio公司；電鏡固定液(貨號(hào)：G1102)購(gòu)自Servicebio公司； 812包埋劑(貨號(hào)：90529-77-4)購(gòu)自SPI公司；胎牛血清(貨號(hào)：A3161002)、DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基(貨號(hào)：C1995500BT)、DMEM含糖培養(yǎng)基(貨號(hào)：C11995500BT)購(gòu)自Gibco公司；PET膜 Transwell 透明嵌套(0.4 μm,貨號(hào)：3450)購(gòu)自Corning公司；100～1 000 μL槍頭(貨號(hào)：CS015)購(gòu)自Excell Bio公司；大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞完全培養(yǎng)(貨號(hào): CM-R105)、大鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基(貨號(hào): CM-R137)、大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(貨號(hào): CM-R108)購(gòu)自Procell公司；濃縮型正常山羊血清(貨號(hào): AR1009)、熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗兔 IgG(貨號(hào): BA1032)購(gòu)自BOSTER公司；TritonX-100(貨號(hào): ST795)、DAPI(貨號(hào): C1002)購(gòu)自碧云天公司；β-tubulin(種屬：兔，貨號(hào):10094-1-AP)、GFAP(種屬：兔，貨號(hào): 16825-1-AP)購(gòu)自Proteintech公司；CD31(種屬：兔，貨號(hào): ab222783)購(gòu)自Abcam公司；BD凋亡試劑盒(貨號(hào): 556547)購(gòu)自BD Pharmingen公司。

1.4 主要儀器Leica UC7型超薄切片機(jī)購(gòu)自Leica公司；Ultra 45°型鉆石切片刀購(gòu)自Daitome公司；HT7700型透射電子顯微鏡購(gòu)自HITACHI公司；MDF-U72V(-80 ℃)超低溫冰箱購(gòu)自日本三洋公司；Eppendorf research plus 移液槍購(gòu)自德國(guó)eppendorf 公司；BS/BT223S電子天平購(gòu)自北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DZG-303A純水機(jī)購(gòu)自上海愛莫電氣科技有限公司；MIC101厭氧箱(含雙流量計(jì)、氧電極)購(gòu)自北京久易科儀科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自Becton Dickinson公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器有限公司；熒光顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯BX53公司。

1.5 在體實(shí)驗(yàn)

1.5.1大鼠CIRI模型的分組、制作 將符合實(shí)驗(yàn)條件的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、動(dòng)物模型組(CIRI)和三七組(PN)。PN組又分為50、100、150 mg·kg-1三個(gè)劑量組。每組10個(gè)大鼠。CIRI組和PN組大鼠參照課題組前期實(shí)驗(yàn)造模方法制作大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈閉塞模型[6]，即大鼠實(shí)驗(yàn)線栓進(jìn)入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈約18～19 mm。假手術(shù)組線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈深度為8～10 mm，未造成腦缺血。缺血2 h后緩慢拔出栓線約1 cm，使Willis環(huán)血流通暢、右側(cè)大腦中動(dòng)脈恢復(fù)血供，完成腦缺血/再灌注損傷，剪掉暴露在術(shù)口外的線栓。

1.5.2選取造模成功的大鼠 CIRI后2 h分別根據(jù)Longa 5級(jí)神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分1～3分的大鼠繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5.3動(dòng)物模型的給藥 PN組內(nèi)每個(gè)劑量組大鼠在CIRI 1～2 h后分別根據(jù)大鼠體重取適當(dāng)?shù)娜叻郏謩e給予已配好的三七溶液灌胃。從低到高劑量組分別對(duì)應(yīng)的三七溶液濃度是5、10、15 g·L-1。首日1次，之后每天2次。Sham、CIRI組大鼠在相同的時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水灌胃。術(shù)后干預(yù)7 d。其余組術(shù)后不予處理。

1.5.4大鼠用藥后神經(jīng)功能學(xué)再評(píng)分 CIRI后7 d再采用Longa 5級(jí)評(píng)分法進(jìn)行各只大鼠的行為學(xué)評(píng)分。

1.5.5大鼠腦梗死體積比的測(cè)定 7 d后，每組取3只大鼠腹腔注射麻醉取腦，切成2 mm厚片。適當(dāng)?shù)?% TTC染液、37 ℃恒溫水浴箱對(duì)腦切片進(jìn)行避光染色，每10 min翻動(dòng)1次。染色時(shí)長(zhǎng)30 min。腦片經(jīng)終止染色、固定24 h后拍照。Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

1.5.6CIRI后大鼠NVU超微結(jié)構(gòu)的觀察 干預(yù)7 d后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)3組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分后腹腔麻醉、心臟放血、斷頭取材，取缺血灶周邊腦組織、剪成小于1 mm3，漂洗(生理鹽水)、室溫固定(3%戊二醛，2 h)、4 ℃固定(3%戊二醛，2 h以上)、漂洗(0.1 mol PBS，3次，45 min)、固定(1%鍔酸，2 h)、酒精脫水(50%、70%、80%、90%、95%各15 min)、包埋(Epon812)、超薄切片(片厚60 nm)、染色(2%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛)，在透射電鏡下采集圖像分析。

1.6 離體實(shí)驗(yàn)

1.6.1三種原代細(xì)胞的培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)報(bào)道所述方法[7-8]，仔細(xì)分離大腦皮層組織，經(jīng)過清洗、消化、吹打、過濾、離心、重懸等步驟后接種于培養(yǎng)瓶中(除神經(jīng)元外，其他無(wú)需多聚賴氨酸提前包被),于CO2孵箱中正常培養(yǎng)。皮層神經(jīng)元培養(yǎng)24 h后向培養(yǎng)液內(nèi)加入阿糖胞苷(5 μmol·L-1)抑制非神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)。48 h后均更換培養(yǎng)基，以后每3 d換液1次，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿。

1.6.2細(xì)胞形態(tài)觀察及免疫熒光鑒定 倒置顯微鏡下對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察后，采用免疫熒光技術(shù)分別對(duì)神經(jīng)元β-Tubulin、星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)爬片、固定、室溫通透、浸洗、封閉、雙抗體孵育、復(fù)染、封片等操作后置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6.3NVU體外模型構(gòu)建 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求將純化培養(yǎng)的單細(xì)胞一起培養(yǎng)于Transwell內(nèi)。首先將Transwell插入池翻轉(zhuǎn)至無(wú)菌飯盒中，將傳代至第3代的星形膠質(zhì)細(xì)胞種植到插入池的外側(cè)面(1.5×105cells·cm-2)，等待4 h至星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后，將Transwell插入池轉(zhuǎn)入六孔板中；2 d后將成熟的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞種植到Transwell插入池內(nèi)池(1.0×105cells·cm-2)，與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)2 d；將共培養(yǎng)的Transwell 插入池放置于已生長(zhǎng)2-3 d左右的神經(jīng)元培養(yǎng)孔中(0.5×105cells·cm-2)，共培養(yǎng)3-4 d；即建成體外NVU共培養(yǎng)模型。

1.6.44 h滲漏實(shí)驗(yàn)[9]細(xì)胞共培養(yǎng)3～4 d后，在Transwell池內(nèi)加滿培養(yǎng)液,使六孔板內(nèi)的培養(yǎng)液液面加至低于Transwell池液面0.5 cm處,培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)4 h后觀察液面變化。若液面無(wú)明顯降低，則造模成功。

1.6.5含藥血清制作 大鼠腦缺血/再灌注7 d，末次給藥1 h后取CIRI組、PN不同劑量組各6只大鼠，分別收集相應(yīng)組別的血液。參照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行處理血制品[9]，最終得到空白血清和PN不同劑量組含藥血清。

1.6.6OGD/R模型制作、分組及給藥 將成功造模的NVU模型隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、細(xì)胞模型組(OGD/R)以及對(duì)應(yīng)在體實(shí)驗(yàn)不同劑量的三七含藥血清組(PN drug serum，PNDS)。OGD/R組、PNDS組制作OGD/R模型，即缺血缺糖培養(yǎng)基置換含糖含血清培養(yǎng)基，然后放入37 ℃、95% N2和5% CO2混合氣缺氧裝置中進(jìn)行OGD 2 h；2 h后，OGD/R組予更換DMEM含糖培養(yǎng)基時(shí)，加入10%的空白血清；PNDS組分別于更換DMEM含糖培養(yǎng)基時(shí)加入10%對(duì)應(yīng)濃度的含藥血清；Control組不作OGD/R處理，但同樣更換含10%空白血清的DMEM含糖培養(yǎng)基；37 ℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧24 h，最終完成OGD/R模型制作。

1.6.74 h滲漏實(shí)驗(yàn) 復(fù)氧20 h時(shí)進(jìn)行，方法同“1.6.4”。

1.6.8細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 各組細(xì)胞于OGD/R 24 h后經(jīng)消化、沖洗，并按照試劑盒步驟操作，流式細(xì)胞儀上機(jī)。單染組校正電壓。

2 結(jié)果

2.1 三七對(duì)CIRI大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響Sham組大鼠無(wú)神經(jīng)缺損癥狀，評(píng)分為0；CIRI 2 h評(píng)分顯示，PN組、CIRI組大鼠評(píng)分無(wú)明顯差異。CIRI 7 d評(píng)分顯示，與Sham組相比，CIRI組出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，評(píng)分有明顯升高(P<0.01)；與CIRI組相比，PN組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯改善(P<0.01)。見Tab 1。

2.2 TTC染色對(duì)各組大鼠腦梗死體積的影響如Fig 1所示，Sham組未見梗死灶，腦梗死體積為0；與Sham組相比，CIRI組出現(xiàn)明顯腦梗死灶，差異顯著(P<0.01)；與CIRI組相比，PN各劑量組腦梗死體積明顯縮小(P<0.01)。見Fig 2。

2.3 各組大鼠腦細(xì)胞透射電鏡下的超微結(jié)構(gòu)變化

2.3.1各組大鼠神經(jīng)元電鏡下形態(tài)學(xué)變化 Sham組(N1)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，部分細(xì)胞器稍擴(kuò)張，但細(xì)胞整體狀態(tài)良好。CIRI組(N2)細(xì)胞膜破裂，核周片狀溶解、水腫，細(xì)胞器流失；核皺縮；現(xiàn)存線粒體結(jié)構(gòu)模糊伴腫脹擴(kuò)張。PN組(N3、N4、N5)細(xì)胞周圍無(wú)明顯水腫；細(xì)胞核無(wú)明顯皺縮，染色質(zhì)分布較均勻；細(xì)胞器結(jié)構(gòu)尚清晰可見，但仍有部分細(xì)胞器腫脹明顯。PN減輕了腦缺血引起的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞器結(jié)構(gòu)狀態(tài)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于CIRI組較好, 如Fig 3。

2.3.27組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞電鏡下形態(tài)學(xué)變化 Sham組(A1)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整；出現(xiàn)染色質(zhì)碎裂現(xiàn)象；部分細(xì)胞器輕度微擴(kuò)張；但整體無(wú)明顯異常改變。CIRI組(A2)細(xì)胞明顯呈空洞樣改變；細(xì)胞核異型改變，核內(nèi)可出現(xiàn)空洞；細(xì)胞器明顯擴(kuò)張，高爾基體板層結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞器內(nèi)大量空泡形成；細(xì)胞整體狀態(tài)不佳。50 mg·kg-1PN組(A3)仍可見腫脹空泡樣細(xì)胞器改變，但較CIRI組相比異常改變略微減輕。100 mg·kg-1PN組(A4)細(xì)胞外形較不規(guī)則，周圍輕度水腫；細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)邊集；大部分細(xì)胞器中度腫脹呈空泡樣。150 mg·kg-1PN組(A5)細(xì)胞水腫、核皺縮、染色質(zhì)改變及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)方面評(píng)價(jià)細(xì)胞狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)PN組減輕了腦缺血引起的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)狀態(tài)相對(duì)于CIRI組較好，見Fig 3。

Tab 1 Effect of Panax Notoginseng on neurological function and behavior scores in each group of

Fig 1 Photographs of brain sections with TTC staining

Fig 2 Effects of Panax Notoginseng on cerebral infarction volume in different groups of

2.3.3各組大鼠微血管電鏡下形態(tài)學(xué)變化 Sham組(B1)內(nèi)皮細(xì)胞周圍連接緊密；微血管管腔通暢；細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊；CIRI組(B2)內(nèi)皮細(xì)胞周圍出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫；微血管管腔狹窄嚴(yán)重；細(xì)胞核異型改變，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊；PN組仍可觀察到細(xì)胞核異型性改變，但總體而言，PN組在微血管管腔、細(xì)胞連接方面較CIRI組均有所減輕。見Fig 3。

2.4 細(xì)胞免疫學(xué)熒光鑒定① 神經(jīng)元β-Tubulin：圖中(Fig 4)紅色熒光為β-Tubulin陽(yáng)性，陽(yáng)性率>90%，即：細(xì)胞純度>90%。② 星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP：圖中(Fig 5)紅色熒光為GFAP 陽(yáng)性，陽(yáng)性率>90%，即：細(xì)胞純度>90%。③ 微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31：圖中(Fig 6)紅色熒光為CD31陽(yáng)性，陽(yáng)性率>90%，即：細(xì)胞純度>90%。

2.5 PN對(duì)NVU共培養(yǎng)模型屏障功能的影響如Tab 2所示，與Control組對(duì)比，OGD/R組transwell池內(nèi)液面明顯下降(P<0.01)；經(jīng)PN含藥血清干預(yù)后的PNDS組液面無(wú)明顯下降，與OGD/R組相比差異較明顯(P<0.01)。

2.6 PN對(duì)NVU共培養(yǎng)模型細(xì)胞凋亡的影響Fig 7、Fig 8分別顯示了各組共培養(yǎng)模型經(jīng)OGD/R處理后的神經(jīng)元及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示， OGD/R組神經(jīng)元、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率較Control組明顯增加(P<0.01)，PN含藥血清干預(yù)后的PNDS組神經(jīng)元、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率有明顯下降(P<0.01)。

3 討論

CIRI是由NVU組分共同參與的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在CIRI作用下受損，進(jìn)一步導(dǎo)致的血管痙攣及繼發(fā)的血管通透性增高加劇腦缺血所致的缺血缺氧損傷；腦缺血早期的逐層放大效應(yīng)可逐漸累及血管周邊的星形膠質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)血腦屏障被破壞，外周有害代謝物質(zhì)侵入并破壞大腦的微環(huán)境；繼而凋亡的星形膠質(zhì)細(xì)胞在CIRI早期分泌興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和炎癥因子破壞周圍的神經(jīng)元。這一系列復(fù)雜的細(xì)胞、分子和代謝事件，歸咎于CIRI發(fā)生后的能量代謝障礙、鈣超載、自由基連鎖反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等過程[9-10]。各個(gè)病理過程相互重疊、相互聯(lián)系、相互加強(qiáng)，導(dǎo)致不可逆的腦損傷。隨著IS病程的進(jìn)展，神經(jīng)血管病變加重，腦缺血灶增大。同時(shí)，缺血性腦損傷破壞血腦屏障，繼而引發(fā)一系列事件，導(dǎo)致腦水腫形成、出血轉(zhuǎn)化和繼發(fā)性神經(jīng)功能不良[11]。臨床上，有超過1/3的腦卒中患者發(fā)生腦血腦屏障破壞，并且與IS后的不良預(yù)后和較低的生存率密切相關(guān)。神經(jīng)元保護(hù)是目前臨床上腦組織保護(hù)的主要手段，但是由于治療靶點(diǎn)的單一性以及缺血損傷過程的不可逆性，其治療作用甚微[12]。神經(jīng)血管單元強(qiáng)調(diào)了NVU整體保護(hù)的重要性。為此有些研究者提出了CIRI的雞尾酒療法[13]，如鈣離子拮抗劑和自由基清除劑的聯(lián)合用藥，以針對(duì)CIRI不同的發(fā)病過程或不同的細(xì)胞靶點(diǎn)；多種藥物合用，一方面有助于IS患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，縮短住院時(shí)間，但是另一方面可能增加了臨床藥物使用的毒副作用，并且極大地增加了人們的負(fù)擔(dān)。

Tab 2 Effects of diverse drug serum on 4 h leakage level difference in NVU co-culture

Fig 3 Ultrastructure of NVU in each group of rats

Fig 4 β-Tubulin of immunofluorescence in neurons(×200)

Fig 5 GFAP of immunofluorescence in astrocytes(×200)

Fig 6 CD31 of immunofluorescence in cerebral microvascular endothelial cells(×200)

Fig 7 Effects of Panax Notoginseng drug serum on neuronal

Fig 8 Effects of Panax Notoginseng drug serum on apoptosis of cerebral microvascular endothelial cells after vs control;**P<0.01 vs OGD/R.

PN治療靶點(diǎn)多且不良反應(yīng)少，具有傳統(tǒng)中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，與CIRI的后的NVU整體治療靶點(diǎn)相契合。研究證實(shí)，PN可通過抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載[14]、抗炎[15]、抑制細(xì)胞凋亡[16]及降低血腦屏障通透性[17]等方面作用于CIRI中多個(gè)病理過程，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)，對(duì)腦缺血損傷有確切療效。我們的研究表明，在大鼠CIRI后1～2 h開始給予PN溶液灌胃，可以顯著降低大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，減少皮層和皮層下梗死體積，以及減輕NVU主要結(jié)構(gòu)損害，從而促進(jìn)大鼠的神經(jīng)行為恢復(fù)。同樣，OGD/R細(xì)胞模型進(jìn)行氧糖剝奪2 h，經(jīng)過PN含藥血清24 h干預(yù)的細(xì)胞凋亡率明顯降低，而且Transwell池內(nèi)滲漏液面無(wú)明顯下降，提示PN在促進(jìn)神經(jīng)元、微血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活，并降低屏障的通透性方面發(fā)揮了重要的作用。表明PN作用于CIRI的機(jī)制之一可能是同時(shí)抑制NVU多種細(xì)胞凋亡，對(duì)NVU具有整體保護(hù)作用。本課題組將繼續(xù)深入研究PN如何多途徑作用于腦缺血/再灌注損傷。