芥子堿硫氰酸鹽對肝癌細胞SMMC-7721增殖、遷移和侵襲的影響及機制

陳騰祥，王婧雅，曾智銳，雷 珊，薛 燕，孫遠梅，楊宇石，蘭金芝

( 貴州醫(yī)科大學 1.基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學教研室、貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室、2. 附屬醫(yī)院病理科、3. 貴州省再生醫(yī)學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

原發(fā)性肝癌是我國死亡率排名第2位的惡性腫瘤。雖然當前肝癌以現(xiàn)代醫(yī)學的治療方法為主，但是中醫(yī)藥辨證論治在中晚期肝癌和術(shù)后不良反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。其優(yōu)點有降低毒副作用、癥狀明顯減輕或帶瘤生存期延長[1-2]。芥子堿硫氰酸鹽(sinapine thiocyanate)存在于十字花科藥用植物之中，是一種季銨鹽，具有抗炎、抗氧化、抗輻射、抗衰老、降壓、抗雄激素活性、抑制新生血管生成等功效, 是一種值得探索的天然藥物[3-4]。然而，芥子堿對肝癌細胞作用及其作用機制，尚不明確。本研究探究芥子堿硫氰酸鹽對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以及對前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS1)和前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)的影響，以期為肝癌治療的新藥研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 肝癌細胞SMMC-7721(貨號:3131C0001000700052)購自北京國家實驗細胞資源共享服務(wù)平臺。

1.1.2試劑 DMEM細胞培養(yǎng)基(貨號:12100046)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS；貨號:FBS10099-141)和0.25%濃度的胰酶(貨號:25200-072)購自美國Gibco生物公司；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO；貨號:D2650)購自美國Sigma；細胞增殖與毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8；貨號:CK04)購自日本同仁生物；Transwell小室(貨號:3422)購自美國康寧生物公司；matrigel膠(貨號:356234)購自美國BD生物公司；高效蛋白裂解液(貨號:P0013B)、蛋白酶抑制劑PMSF(貨號:ST505)、制膠試劑盒(貨號:P0690)和BCA定量試劑盒(貨號:P0012)購自杭州碧云天生物；多克隆抗體PTGS1(貨號:13393-1-AP)、PTGS2(貨號:12375-1-AP)、Bax(貨號:50599-2-Ig)、Bcl-2(貨號:12789-1-AP)、MMP-2(貨號:10373-2-AP)、MMP-9(貨號:10375-2-AP)和單克隆抗體β-actin(貨號:66009-1-Ig)購自武漢三鷹生物公司；山羊抗兔(貨號:AS014)和山羊抗鼠二抗(貨號:AS003)購自武漢愛博泰克生物公司；ECL高敏曝光液(貨號:36222ES60)購自武漢聚能生物公司；芥子堿硫氰酸鹽(純度>98%；貨號:HY-N0450)購自武漢MCE生物公司。

1.1.3儀器 細胞培養(yǎng)超凈工作臺(型號:SW-CJ-2D)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；細胞恒溫培養(yǎng)箱(型號:HERAcell 240i)購自美國Thermo公司；多功能酶標儀(型號:Epoch)購自美國BioTek公司；倒置顯微鏡(型號:CX23)購自日本奧林巴斯公司；Western blot凝膠成像系統(tǒng)(型號:Biorad GelDoc XR)購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及藥物配制 肝癌細胞SMMC-7721用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞長至80%時，胰酶消化后傳代。狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。芥子堿硫氰酸鹽粉末用DMSO配制成10 mol·L-1濃度的母液，過濾除菌后置于-20 ℃儲存；使用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋成各個濃度的工作液。

1.2.2CCK-8實驗檢測細胞存活 胰酶消化處于對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞，制備細胞懸液。細胞計數(shù)后，于96孔板每孔種植3×103個細胞，每組設(shè)置6個復(fù)孔。待細胞貼壁后，分別用25、50和100 μmol·L-1濃度的芥子堿硫氰酸鹽處理細胞，以添加含有等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)液(即0 μmol·L-1)為對照組。藥物處理48 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入含10 μL CCK-8液的100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔的吸光度。

1.2.3劃痕實驗檢測細胞遷移能力 肝癌細胞SMMC-7721以每孔2×105個的密度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)至至匯合度達95%以上。用200 μL移液器槍頭細胞單層上做劃線。PBS漂洗3次后，添加含不同濃度(25、50和100 μmol·L-1)芥子堿硫氰酸鹽的無血清DMEM培養(yǎng)液。對照組則加入含等體積DMSO的無血清DMEM培養(yǎng)液。在劃痕后0和24 h，隨機選取5個視野在倒置顯微鏡下進行拍照。劃痕面積在Image Pro Plus軟件中測量，每組的相對遷移率用以下公式計算:相對遷移率/ %=(各藥物組0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/(對照組0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)×100%。

1.2.4Transwell小室法檢測細胞侵襲能力 以1 ∶8的體積比混勻Matrigel膠和無血清DMEM培養(yǎng)基后鋪到Transwell的上室中。在37 ℃培養(yǎng)箱烘干matrigel后吸掉多余培養(yǎng)基。肝癌細胞SMMC-7721重懸后取200 μL含4×104個細胞的懸液滴置于上室里，再分別加入不同濃度(25、50和100 μmol·L-1)芥子堿硫氰酸鹽，對照組加入等體積DMSO。下室放置700 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h后以4%多聚甲醛固定Transwell小室，PBS漂洗2次后，結(jié)晶紫染色15 min。用棉簽擦拭掉非侵襲細胞后，每孔隨機選取5個視野拍照。

1.2.5蛋白靶點分析 利用在線數(shù)據(jù)庫Targetnet(http://targetnet.scbdd.com/home/index/)，導(dǎo)入化合物的化學結(jié)構(gòu)式，基于QSAR模型預(yù)測化合物作用的蛋白靶點。得到作用的蛋白靶點信息后，應(yīng)用Cytoscape軟件對芥子堿硫氰酸鹽調(diào)控的蛋白靶點可視化。進一步把蛋白靶點信息導(dǎo)入至在線數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)中進行通路富集分析。P<0.05的通路則為顯著性富集的通路。

1.2.6計算機分子對接 從Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫中下載PTGS1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(ID: 6Y3C)和PTGS2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(ID: 5IKR)。同時，從PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)下載芥子堿硫氰酸的三級結(jié)構(gòu)。PTGS1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)、PTGS2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和芥子堿硫氰酸的三級結(jié)構(gòu)均導(dǎo)入到SYBYL軟件，對蛋白晶體結(jié)構(gòu)清除原結(jié)合分子、修復(fù)粘性末端和加氫處理。以自動識別模式識別蛋白的活性口袋后，運用DOCKING功能對接芥子堿硫氰酸與PTGS1和PTGS2的活性口袋，根據(jù)結(jié)合打分(C-score:0～5)判斷分子與蛋白穩(wěn)定結(jié)合的可能性。C-score在4～5分范圍則可認為分子與蛋白能夠穩(wěn)定結(jié)合。

1.2.7Western blot檢測PTGS1、PTGS2、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9的表達變化 用不同濃度(25、50和100 μmol·L-1)的芥子堿硫氰酸鹽和含等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)基處理肝癌SMMC-7721細胞24 h后，棄掉培養(yǎng)基，用含2% PMSF蛋白酶抑制劑的預(yù)冷強效裂解液裂解細胞。離心后，吸取蛋白上清液后以BCA法進行定量。25 μg蛋白經(jīng)10%分離膠90 V恒定電壓電泳2 h后，300 mA恒流2 h轉(zhuǎn)至PVDF膜上。常溫下封閉2 h，分別加入稀釋度為1 ∶1 000的一抗PTGS1、PTGS2、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9和β-actin在4 ℃過夜。TBST洗滌3次，加入稀釋度為1 ∶2 000的二抗在室溫搖床中孵育2 h。滴加高敏ECL曝光液后于成像儀中進行顯影。測量條帶的灰度值后，以β-actin為內(nèi)參，計算蛋白的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 芥子堿硫氰酸鹽明顯抑制肝癌細胞SMMC-7721增殖CCK-8結(jié)果顯示，0、25、50和100 μmol·L-1的芥子堿硫氰酸鹽處理48 h后，各組肝癌細胞SMMC-7721的增殖率依次為(100±6.8)%、(85.1±7.1)%、(59.2±10.9)%和(39.8 ± 6.2)%(Fig 1)。與對照組相比，各組增殖率均明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示芥子堿硫氰酸鹽能夠明顯抑制肝癌細胞SMMC-7721的增殖。

Fig 1 Effects of different concentrations of sinapine thiocyanate on SMMC-7721 proliferation at 48 h n=3)

2.2 芥子堿硫氰酸鹽抑制肝癌細胞SMMC-7721遷移劃痕實驗結(jié)果顯示，0(即對照組)、25、50和100 μmol·L-1芥子堿硫氰酸鹽處理組的SMMC-7721細胞的相對遷移率分別為(100.0 ± 9.2)%、(77.1 ± 7.2)%、(48.2 ± 10.4)%和(35.1 ± 7.1)%(Fig 2)。與對照組相比，各組SMMC-7721細胞相對遷移率均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示芥子堿硫氰酸鹽能夠明顯抑制肝癌細胞SMMC-7721的遷移。

2.3 芥子堿硫氰酸鹽抑制肝癌細胞SMMC-7721侵襲Transwell小室實驗結(jié)果顯示，0(即對照組)、25、50和100 μmol·L-1芥子堿硫氰酸鹽處理組的每視野下侵襲過膜的細胞數(shù)分別為(206 ± 22)個、(116 ± 13)個、(67 ± 12)個和(37 ± 8)個(如Fig 3)。與對照組相比，各濃度處理組中肝癌細胞SMMC-7721的侵襲能力均明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 芥子堿硫氰酸鹽作用的蛋白靶點預(yù)測及通路富集分析利用在線數(shù)據(jù)庫Targetnet，預(yù)測出27個芥子堿硫氰酸鹽作用的蛋白靶點(Fig 4A)。對27個芥子堿硫氰酸鹽作用蛋白靶點進行通路富集分析，結(jié)果顯示，芥子堿硫氰酸鹽的蛋白靶點明顯富集的通路在氮代謝、含有血清素的神經(jīng)突觸調(diào)控、脂肪細胞內(nèi)脂肪細胞的分解調(diào)節(jié)以及花生四烯酸代謝等4個通路上(Fig 4B)。其中，蛋白靶點PTGS1和PTGS2富集在包括含有血清素的神經(jīng)突觸調(diào)控、脂肪細胞內(nèi)脂肪細胞的分解調(diào)節(jié)以及花生四烯酸代謝等在內(nèi)的多個信號通路中(Tab 1)。因此，PTGS1和PTGS2被視為芥子堿硫氰酸鹽的核心作用靶點。

2.5 計算機分子對接芥子堿硫氰酸鹽與PTGS1和PTGS2蛋白的活性口袋為進一步探討芥子堿硫氰酸鹽對核心作用靶點PTGS1和PTGS2的調(diào)控，我們進行了計算機分子對接。結(jié)果顯示，芥子堿硫氰酸鹽均能與PTGS1和PTGS2的活性口袋結(jié)合，并“包埋”在活性口袋內(nèi)，C-score得分(0～5)分別為4分和5分(Fig 5)。結(jié)果顯示芥子堿硫氰酸鹽能夠穩(wěn)定結(jié)合PTGS1和PTGS2蛋白，提示其發(fā)揮功能可能是通過調(diào)控PTGS1和PTGS2蛋白介導(dǎo)的。

2.6 芥子堿硫氰酸鹽對PTGS1、PTGS2、Bax、Bcl-2、MMP-2和MMP-9表達的影響用不同濃度(0、25、50和100 μmol·L-1)的芥子堿硫氰酸鹽處理肝癌細胞SMMC-7721后，蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，與對照組(即0 μmol·L-1芥子堿硫氰酸鹽組)相比，各濃度處理組肝癌細胞中PTGS1、PTGS2、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白的相對表達量均明顯減少，Bax蛋白的相對表達量明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(Fig 6，P<0.05)。結(jié)果提示，芥子堿硫氰酸鹽可能是通過靶向抑制PTGS1和PTGS2的表達，進而減少SMMC-7721細胞的增殖、遷移和侵襲。

Tab 1 Enrichment analysis of targets of sinapine thiocyanate

Fig 2 Effects of sinapine thiocyanate on SMMC-7721 on migration of hepatocellular carcinoma cells by wound healing assay(×40) n=3)

Fig 3 Effects of sinapine thiocyanate on invasion of SMMC-7721 hepatocellular carcinoma cells by

3 討論

肝癌是一類預(yù)后極差的惡性消化系統(tǒng)腫瘤,由于發(fā)病隱匿、進展迅速，患者的死亡率較高。目前，肝癌臨床治療方法主要有外科干預(yù)和全身療法[5]。當前, 肝癌的發(fā)生機制尚不明確[6]。但肝癌早期發(fā)病隱匿,病情發(fā)展迅速,且易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移,所以大部分患者就診時已錯過最佳的手術(shù)治療時間。應(yīng)用中藥或中藥有效成分治療肝癌許多優(yōu)勢,如緩解術(shù)后不良反應(yīng)、增強免疫力、協(xié)同化療藥物，以及提高生活質(zhì)量等[7-8]。

Fig 4 Bioinformatics analysis for targets of sinapine thiocyanate

Fig 5 Stable binding of sinapine thiocyanate to active pocket of PTGS1 and PTGS2 shown by computer molecular docking C-score ≥ 4 was set as cut-off to consider the stable binding

芥子堿硫氰酸鹽是十字花科藥用植物中的一種季銨鹽提取物，在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病中都有著明顯作用。Li等[9]發(fā)現(xiàn)，鉤藤總堿與芥子堿硫氰酸鹽聯(lián)合使用能夠下調(diào)凝血相關(guān)酶的表達，從而抑制血管內(nèi)皮的促凝狀態(tài)。劉曉莉等[10]表明，芥子堿對多種乳腺癌細胞均有抑制作用。Fan等[11]研究發(fā)現(xiàn)硫氰酸芥子堿的經(jīng)皮吸收可對哮喘有治療作用。本研究應(yīng)用CCK-8實驗、劃痕實驗和Transwell小室實驗，發(fā)現(xiàn)芥子堿硫氰酸鹽能夠明顯抑制肝癌細胞SMMC-7721的增殖、遷移和侵襲。提示芥子堿硫氰酸鹽是一種有潛力的抗肝癌藥物。

PTGS也被叫做環(huán)氧合酶，是合成前列腺素等的產(chǎn)物的關(guān)鍵酶體。PTGS有兩種同功酶，即結(jié)構(gòu)型的PTGS1和誘導(dǎo)型的PTGS2。在生理狀態(tài)下，這兩種同工酶的表達以及功能上是有明顯的區(qū)別[12]。PTGS1是一種具有重要生理意義的前列腺素合成酶。PTGS1是一種固有的管家酶，主要在胃、腎和血小板中表達，其基本功能包括調(diào)節(jié)外周血管阻力、維持腎血流量、保護胃粘膜和調(diào)節(jié)血小板聚集。PTGS1也被認為在炎癥、關(guān)節(jié)炎和癌癥的病理生理過程中起關(guān)鍵作用[13]。在正常組織中PTGS2含量極少,其可推動花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，在缺氧、炎癥因子、致癌物質(zhì)、生長因子等條件下可促進PTGS2的表達[14]。目前，大量研究表明，PTGS1和PTGS2在肝癌中高表達，且與肝癌的進程有著密切關(guān)系。如PTGS2可激活WNT/2表達，且與肝癌的信號通路調(diào)控人肝癌細胞VEGF表達，進而促進肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移[15]；人工合成的小分子化合物SC-560(一種選擇性PTGS1抑制劑)明顯抑制肝癌細胞的生長并介導(dǎo)細胞凋亡[16]。此外，PTGS1抑制劑與選擇性PTGS2抑制劑的組合，對細胞生長抑制有協(xié)同作用。這些結(jié)果提示PTGS1和PTGS2抑制劑可能在肝癌患者中具有潛在的治療意義[17]。在我們研究中，通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測PTGS1和PTGS2是芥子堿硫氰酸鹽的核心作用靶點。同時，我們進行了計算機分子對接，發(fā)現(xiàn)芥子堿硫氰酸鹽可以穩(wěn)定結(jié)合PTGS1和PTGS2蛋白的活性口袋。我們進一步通過Western blot發(fā)現(xiàn)，不同濃度芥子堿硫氰酸鹽能夠明顯抑制PTGS1和PTGS2的表達，同時均促進促凋亡因子Bax的表達量增加，減少抗凋亡因子Bcl-2和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達量。

Fig 6 Effects of sinapine thiocyanate on expression of PTGS1, PTGS2, Bcl-2, Bax, MMP-2 and MMP-9 proteins in SMMC-7721 cells detected by Western blot n=3)

綜上所述，芥子堿硫氰酸鹽可能通過靶向PTGS1和PTGS2抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。芥子堿硫氰酸鹽可能成為治療肝癌的有效中藥之一。