基于斑馬魚模型研究抗氧化活性十肽YSQLENEFDR的抗帕金森癥活性

黨 姣，張姍姍，季秀娜，劉可春，靳 夢

[齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生物研究所，山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室,山東 濟南 250103]

帕金森癥(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見的第二大神經系統(tǒng)退行性疾病，65 歲以上人群中患病率高達1.7%，僅次于阿爾茲海默癥[1]。該病臨床癥狀主要為震顫、動作遲緩、肌強直等行為性障礙，還會伴隨有睡眠障礙、認知功能下降、自主神經功能紊亂等一系列非行為性障礙[1-2]。PD主要病理特征為黑質多巴胺(dopamine，DA)神經元的減少和形成以α-syn為主要成分的路易小體(Lewy-body，LB)[3]。PD的發(fā)病機制復雜多變，目前尚未明確。但有研究發(fā)現(xiàn)，PD與自噬系統(tǒng)有關，自噬系統(tǒng)的損傷會導致蛋白的積累和聚集，產生細胞毒性和神經退行性病變。也有研究表明，氧化應激、蛋白酶體損傷以及線粒體功能紊亂等是PD潛在的發(fā)病機制。近年來已經發(fā)現(xiàn)的與PD相關的基因包括α-syn、parkin、dj1等[4-5]。α-syn和parkin基因的突變使泛素蛋白酶體降解，從而導致毒性蛋白聚集沉積[3，6]；parkin的基因突變會造成線粒體功能紊亂[7]；dj1具有抗氧化應激的作用[8]等。

海洋生物體內富含多種生物活性化合物，具有抗氧化的生物活性，因此在預防和治療慢性非傳染性疾病(如PD、阿爾茲海默癥等)具有潛在的價值[9]。諸多實驗證實，抗氧化劑或具有抗氧化活性的物質能夠有效清除活性自由基，具有神經保護作用[10]。在人體內，線粒體呼吸通常會產生一些強氧化劑，Complex I的抑制作用會增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)超氧化物的產生，ROS超氧化物可形成有毒的羥自由基，或者形成過氧亞硝基，這些分子作用于核酸、蛋白質和脂類等物質而引起細胞損傷[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，來源于海螺肉提取物中的一種十肽YSQLENEFDR具有較強的抗氧化能力，可清除體外自由基及抑制斑馬魚體內氧化損傷[11]，但海螺源抗氧化活性十肽YSQLENEFDR是否具有抗PD活性仍未可知。目前常見的PD治療藥物對于人體都有或多或少的副作用，如服用左旋多巴極易引發(fā)胃部不良反應[12]；多巴胺受體激動劑可有效改善患者的臨床癥狀，但會造成患者惡心、失眠等不良反應[13]。并且這些藥物只能改善癥狀，并不能延緩PD進程。天然來源的食源性十肽YSQLENEFDR除其自身所具有高抗氧化活性外[11]，相對更加安全，更適用于長期服用。

斑馬魚體型小且透明、發(fā)育繁殖快、飼養(yǎng)經濟且具有無需解剖便可觀察各器官發(fā)育情況的優(yōu)勢[16]。最重要的是，斑馬魚的基因序列與人類的基因序列有著極高的相似度，所以被認為是優(yōu)良的建立神經退行性疾病模型的動物資源[14]。Vmat、Fli1分別特異性表達于斑馬魚DA神經元與血管中，因此轉基因斑馬魚Vmat:GFP、Fli1:GFP分別用于評價DA神經元、腦部血管的發(fā)育狀況。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-terahydropyridine，MPTP)是一種神經毒性物質，在斑馬魚中常被用來誘導PD模型。

本實驗以斑馬魚為模型，主要觀察并記錄不同處理組的斑馬魚多巴胺神經元以及腦部血管的發(fā)育情況，斑馬魚行為以及PD相關基因表達變化，以此來探究抗氧化活性十肽YSQLENEFDR是否具有抗PD活性。具體步驟如Fig 1所示。

Fig 1 Flow chart of experiment

1 材料與方法

1.1 材料YSQLENEFDR(純度為99.02%)由合肥賽曼諾生物科技有限公司合成。轉基因斑馬魚Vmat∶GFP，轉基因斑馬魚Fli1 ∶GFP，野生型斑馬魚AB品系均由山東省科學院生物研究所藥物篩選平臺提供。

斑馬魚培養(yǎng)及胚胎的準備：成年雌雄斑馬魚分開培養(yǎng)于水溫26 ℃斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中，照明黑暗14 h ∶10 h交替進行，每日定時喂食。實驗前一晚，選擇成熟斑馬魚按雌雄比例2 ∶2，放入產卵缸中。次日早上8：30抽取隔板，2 h后收取魚卵，將死卵剔除，養(yǎng)殖水反復沖洗3次，移入含2 mg·L-1亞甲基藍的養(yǎng)殖水中，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中控光培養(yǎng)，以備后續(xù)實驗使用。

MPTP、亞甲基藍、1-苯基-2-硫脲(PTU)(美國Sigma公司)；RNA試劑盒(RN2802，北京艾德萊生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(RR036A、RR091A TaKaRa公司)。

斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng)(北京愛生科技公司)、體視熒光顯微鏡 (德國蔡司公司)、實時熒光定量PCR儀(羅氏診斷產品有限公司)、超微量分光光度計(基因有限公司)、C1000 Touch 梯度PCR儀(Bio-Rad公司)、Zebrabox斑馬魚行為分析儀(Viewpoint公司)等。

1.2 方法

1.2.1十肽YSQLENEFDR的制備 基于課題組已建立的酸醇浸提法結合活性導向分離純化法[10]，制備海螺活性十肽，即取香螺組織，磨碎，勻漿，加入10倍量的酸性稀乙醇溶液(冰醋酸調整溶液pH值至5)，30 ℃攪拌提取6 h，離心，取上層清液，減壓濃縮至無醇味，正己烷萃取脫除脂溶性部分，下層溶液冷凍保存，即得粗多肽提取物。隨后，通過體外活性導向分離法，分離純化富集得到海螺十肽樣品，經蛋白定性確定其氨基酸組成，采用固相合成技術，制備YSQLENEFDR (Tyr-Ser-Gln-Leu-Glu-Asn-Glu-Phe-Asp-Arg)樣品。

1.2.2實驗分組及處理 將受精后1 d的胚胎進行脫膜處理，放于6孔板中，每孔放入20條斑馬魚，分為以下5組：空白對照組、50 μmol·L-1MPTP處理組、50 μmol·L-1MPTP與不同濃度(2、10、50 mg·L-1)抗氧化活性十肽YSQLENEFDR共處理組。另外需以0.003%(W/V)PTU處理轉基因斑馬魚Vmat∶GFP、Fli1 ∶GFP，目的在于抑制黑色素的形成，便于后期在顯微鏡下觀察記錄。加完藥后，將其放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每日換藥。

1.2.3多巴胺神經元及腦血管的檢測 4 dpf時，在蔡司體視熒光顯微鏡下，選取不同實驗組的轉基因斑馬魚Vmat∶GFP、Fli1 ∶GFP分別觀察DA神經元與腦部血管發(fā)育情況。

1.2.4行為學監(jiān)測 5 dpf時，將野生型斑馬魚AB的不同組別放入48孔板中，1條/孔，加養(yǎng)魚水1 mL/孔，將48孔板放入Zebrabox斑馬魚行為分析儀暗箱中，先使其適應環(huán)境。15 min后開始進行行為學檢測，檢測時間設置為20 min。運用Zeblab軟件進行數據處理，計算每條魚游動總距離和平均速度。

1.2.5熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測PD相關基因的表達 每組取5 dpf的野生型斑馬魚AB幼魚(n=20)進行qRT-PCR檢測。RNA的提取參照試劑盒說明書，利用超微量分光光度計測定提取的RNA的濃度，A260/A280應在2.0～2.5之間；RNA反轉為cDNA參照反轉錄試劑盒說明書；Real-time PCR參照實時熒光定量PCR說明書。Real-time PCR擴增結束后輸出對照組和待測組目的基因CT及內參基因rpl13a的CT值，以相對定量法用2-ΔΔCT計算各組基因的相對表達量。

2 結果

2.1 十肽YSQLENEFDR對斑馬魚DA神經元的保護作用4 dpf時斑馬魚DA神經元已發(fā)育完全。從斑馬魚DA神經元區(qū)域長度來看，F(xiàn)ig 2所示，與空白對照組相比，MPTP處理組的DA神經元長度明顯減少且具有統(tǒng)計學意義；與MPTP處理組相比，不同濃度的十肽YSQLENEFDR與MPTP共處理組中DA神經元長度逐漸增加且均具有統(tǒng)計學意義。從斑馬魚DA神經元區(qū)域熒光密度總和來看，與空白對照組相比，MPTP處理組的DA神經元區(qū)域熒光密度總和明顯下降且差異具有統(tǒng)計學意義；與MPTP處理組相比，十肽YSQLENEFDR與MPTP共處理組中DA神經元區(qū)域熒光密度在濃度為2 mg·L-1時有略微的升高，但差異無統(tǒng)計學意義，而在10 mg·L-1和50 mg·L-1時明顯升高。綜上所述，在十肽YSQLENEFDR濃度為50 mg·L-1時對DA神經元的保護作用最佳。研究結果表明，十肽YSQLENEFDR對DA神經元具有保護作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性。

2.2 十肽YSQLENEFDR可以緩解斑馬魚PD狀行為5 dpf時，對不同實驗組的野生型斑馬魚AB(n=8)進行行為學測試，結果見Fig 3。Fig A為不同組別的野生型斑馬魚AB的游動總距離和運行軌跡，軌跡圖中紅色線、綠色線、黑色線分別表示游動速度的快、中、慢速。與空白對照組相比，MPTP處理組斑馬魚游動總距離明顯減少(Fig 3A，MPTP組所示)，平均速度變慢(Fig 3B，MPTP組所示)；與MPTP處理組相比，MPTP與十肽YSQLENEFDR共同處理組在2 mg·L-1時游動總距離略微增加但差異不具有統(tǒng)計學意義，10 mg·L-1和50 mg·L-1共處理組游動總距離明顯增加，斑馬魚的運動能力恢復且具有統(tǒng)計學意義(Fig 3A，2、10、50 mg·L-1組所示)，平均速度變快(Fig 3B，2、10、50 mg·L-1組所示)。研究結果表明，十肽YSQLENEFDR可以緩解由MPTP造成的斑馬魚PD狀行為，且具有一定的濃度依賴性。

Fig 2 Decapeptide YSQLENEFDR protected

Fig 3 The relieving effect of decapeptide YSQLENEFDR on Parkinson-like behavior in zebrafish

2.3 十肽YSQLENEFDR可以拯救斑馬魚腦血管損傷4 dpf時，空白對照組中斑馬魚腦血管清晰可見(Fig 4，control組所示)。與空白對照組相比，MPTP處理組中斑馬魚腦血管嚴重損傷，血管密度明顯減少(Fig 4，MPTP組所示)。與MPTP處理組相比，十肽YSQLENEFDR與MPTP共處理組中腦血管密度隨著十肽YSQLENEFDR的濃度增加逐漸增加，其中50 mg·L-1十肽YSQLENEFDR與MPTP共處理組拯救回的腦血管數量最多(Fig 4，50 mg·L-1組)。研究結果表明，十肽YSQLENEFDR可以改善由MPTP造成的腦血管損傷，并且在一定范圍內，濃度越高改善效果越明顯。

Fig 4 Decapeptide YSQLENEFDR decreased

2.4 十肽YSQLENEFDR對PD相關基因表達的影響為了進一步研究十肽YSQLENEFDR抗PD活性的內在機制，采用qRT-PCR檢測不同實驗組 (n=20) PD相關基因α-syn、parkin、dj1、uchl1、ulk1b、ulk2和pink1在斑馬魚體內的表達水平。與空白對照組相比，MPTP處理組中α-syn、ulk1b的表達明顯上調，ulk2的表達明顯下調，而parkin、dj1、uchl1、pink1的表達變化無統(tǒng)計學意義。與MPTP處理組相比，經十肽YSQLENEFDR處理后，α-syn、parkin、uchl1和ulk1b的表達明顯下調且具有統(tǒng)計學意義；dj1在2 mg·L-1和50 mg·L-1時的表達明顯下調，10 mg·L-1并無明顯變化；ulk2、pink1在2、10和50 mg·L-1均無明顯變化。結果顯示，經十肽YSQLENEFDR處理后，除ulk2、pink1外各基因在斑馬魚體內的表達水平均有明顯變化，說明十肽YSQLENEFDR能夠影響由MPTP造成的基因異常表達。

Fig 5 Gene expression of α-syn, parkin,dj1,uchl1,

3 討論

PD是僅次于阿爾茲海默癥的第二大神經退行性疾病，嚴重影響患者的生活質量，特別是老年人，所以研究如何治療和緩解PD勢在必行。

本實驗旨在探究海螺源的具有抗氧化活性十肽YSQLENEFDR的抗PD活性。實驗中用MPTP誘導的斑馬魚PD模型，出現(xiàn)了多巴胺神經元及腦部血管缺失明顯，行為異常和PD相關基因表達異常等現(xiàn)象，說明斑馬魚PD模型建立成功。與MPTP處理的斑馬魚相比，MPTP與十肽YSQLENEFDR共處理組的斑馬魚多巴胺神經元的缺失隨著十肽YSQLENEFDR濃度的增加有明顯的改善。十肽YSQLENEFDR對于斑馬魚PD模型腦部血管損傷也表現(xiàn)出一定的拯救作用。MPTP與十肽YSQLENEFDR共處理組的斑馬魚游動能力明顯恢復，游動總距離增加，平均游動速度變快。以上各檢測結果表明十肽YSQLENEFDR具有抗PD活性，且在濃度為50 mg·L-1時，其緩解PD的能力最佳。

蛋白質是生物體內主要發(fā)揮功能的物質，所以通過檢測蛋白質表達變化從而研究藥物、化合物發(fā)揮作用的靶點、上下游通路關系是比較直觀的方法。但是市面上所售關于斑馬魚的抗體比較少，在沒有合適抗體的情況下，檢測基因表達變化是一個比較方便的方法，基因的上調和下調可以間接反映蛋白的變化過程。近年來的研究表明，參與PD發(fā)生發(fā)展的基因包括α-syn、parkin、dj1、uchl1、ulk1b、ulk2、pink1、LRRK2、ATP13A2。大量α-syn蛋白聚集形成LB，導致PD。本研究發(fā)現(xiàn)經MPTP處理后，α-syn的表達明顯上升，而十肽YSQLENEFDR處理后，α-syn的表達明顯下調，提示十肽YSQLENEFDR降低了α-syn蛋白聚集。parkin作為E3泛素連接酶，能從胞質轉移到線粒體中，泛素化線粒體蛋白，形成自噬體，使損傷的線粒體通過自噬體被降解[6]。經MPTP處理后，parkin的表達上調，提示MPTP可能對線粒體造成損傷，機體自我保護從而提高parkin的表達。而十肽YSQLENEDR處理后，parkin的表達明顯下調，提示十肽YSQLENEFDR能夠緩解線粒體損傷。dj1具有抗氧化應激作用，在氧化應激下，dj1會向線粒體遷移富集，在線粒體中的dj1具有更強的細胞保護作用[8]。經MPTP處理后，dj1的表達上調，而十肽YSQLENEFDR處理后，dj1的表達明顯下調，提示十肽YSQLENEFDR可能具有抗氧化應激的作用。uchl1參與調解細胞的增生、分化和凋亡[15]。經MPTP處理后，uchl1的表達上升，提示MPTP可能對細胞造成損傷，機體自我保護從而提高uchl1的表達，而十肽YSQLENEFDR處理后，uchl1的表達明顯下調，提示十肽YSQLENEFDR能夠緩解MPTP所造成的細胞損傷，對細胞有保護作用。ulk1b的過表達會抑制自噬[15]，誘發(fā)PD。經MPTP處理后，ulk1b的表達明顯上升，提示MPTP可能抑制自噬，十肽YSQLENEFDR處理后，ulk1b的表達明顯下調，提示十肽YSQLENEFDR能夠激活自噬。ulk2能阻止不溶性泛素化蛋白聚集物的積累[15]。經MPTP處理后，ulk2的表達明顯下調，提示MPTP可能會導致不溶性泛素化蛋白無法降解而大量積累，使PD惡化，十肽YSQLENEFDR處理后，ulk2的表達無明顯變化，提示十肽YSQLENEFDR可能不是通過調節(jié)ulk2的表達來緩解PD。以往研究表明pink1功能異常造成線粒體損傷[7]。經MPTP處理后，pink1的表達沒有明顯變化，十肽YSQLENEFDR處理后也并未對pink1的表達造成明顯的影響，提示pink1在MPTP誘導的斑馬魚PD模型中未發(fā)揮重要作用。調節(jié)PD的重要基因還包括LRRK2、ATP13A2等。LRRK2和ATP13A2均參與調節(jié)多巴胺神經元損傷。LRRK2的突變能夠造成多巴胺神經元的損傷[16]。ATP13A2的過表達能明顯減少多巴胺神經元的變性丟失[17]。但十肽YSQLENEFDR是否能通過調節(jié)多巴胺神經元相關基因從而緩解PD，其具體機制仍需進一步研究。

本研究中MPTP誘導組的基因α-syn等表達下調，ulk1b等表達上調，與之前研究基因表達一致，同時也證明了斑馬魚PD模型建立的成功。不同濃度的十肽YSQLENEFDR能夠調節(jié)與PD相關基因的異常表達，使各基因的表達趨平于空白對照組，推測十肽能夠通過減少α-syn蛋白的聚集，緩解線粒體損傷，抗氧化應激作用等，來緩解PD，但具體的機制仍需要進一步的研究。

海螺來源的抗氧化活性十肽YSQLENEFDR能夠保護斑馬魚DA神經元且對于腦部血管具有改善作用，能夠緩解帕金森癥行為，調控與帕金森癥相關基因的異常表達，具有抗帕金森癥活性。

(致謝:本實驗于山東省科學院生物研究所藥物篩選研究室完成，在此表示衷心感謝!)