基于PKD1/HDAC7軸研究丹參酚酸B對(duì)大鼠缺血心肌組織的保護(hù)作用

劉 暖，楊 雷，劉 萍

(南陽(yáng)理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473004)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)等缺血性疾病會(huì)引發(fā)大量心肌細(xì)胞死亡，導(dǎo)致患者左心室不良重構(gòu)、心功能受損、生活質(zhì)量低下[1]。丹參為治療MI等缺血性心肌疾病的經(jīng)典中藥材之一，丹參酚酸B(salvianolic acid B，SAB)屬于水溶性酚酸類(lèi)化合物，為丹參的代表性單體成分[2]。課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，蛋白激酶D1(protein kinase D1，PKD1)具有促進(jìn)血管新生的作用[3-4]，并且可以下調(diào)MI后心肌膠原蛋白的表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)MI后的心室重塑，保護(hù)缺血受損的心肌[5]。PKD1在體內(nèi)發(fā)揮上述對(duì)缺血心肌的部分保護(hù)效應(yīng)需要依賴(lài)和IIa類(lèi)組蛋白去乙?；?(group IIa histone deacetylase 7，HDAC7)的結(jié)合，形成PKD1/HDAC7軸才能夠完成[6]。CID755673為PKD1的特異性阻斷劑。本研究擬分析MI大鼠SAB給藥及應(yīng)用阻斷劑14 d后心肌組織的形態(tài)學(xué)變化及PKD1和HDAC7蛋白的表達(dá)，闡述SAB是否通過(guò)調(diào)控PKD1/HDAC7軸保護(hù)缺血受損的心肌組織。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只Wistar大鼠，SPF級(jí)，♂，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自北京維通利華公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011；動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):11400700315978。

1.2 藥物與試劑SAB(上海陶素公司，批號(hào):115939-25-8)，CID755673(簡(jiǎn)稱(chēng)CID，美國(guó)MCE公司，批號(hào):2018276)；TUNEL染色試劑盒(上海翊圣公司，批號(hào):40308ES20)；PKD1(上海圣克魯斯公司，批號(hào):Sc-1796)、HDAC7(武漢三鷹生物公司，批號(hào):DF6435)的一抗抗體；Cy3熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(武漢博士德公司，批號(hào):BA1032)；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器LSM 800激光共聚焦顯微鏡和ZEN 2.3 lite分析軟件(德國(guó)蔡司公司)；CUT6062病理切片機(jī)和MTMI全密閉自動(dòng)脫水機(jī)(德國(guó)賽利公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、心梗模型組(MI)、SAB給藥組(SAB)和CID阻斷劑組(CID)。結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制MI模型，Sham組不進(jìn)行結(jié)扎操作，其他手術(shù)程序和MI組保持一致。14 d實(shí)驗(yàn)周期中，大鼠均腹腔注射給藥，具體給藥劑量為:SAB組:50 mg·kg-1·d-1，CID組:50 mg·kg-1·d-1SAB+40 μg·kg-1·d-1CID，Sham和MI組:等量生理鹽水。14 d后，處死大鼠，進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.2 HE染色將處死后大鼠的心臟剪取左心室，含室間隔部分，參照之前的方法[3]，制成纖薄的組織切片，HE染色，厚度4 μm，置入普通顯微鏡的40×物鏡鏡頭下觀察。

2.3 Masson染色組織取材同HE染色。參照之前的方法[3]，制成Masson染色切片。染色后，以膠原纖維為主的肉芽和瘢痕組織示藍(lán)綠色，心肌組織示紅色。膠原纖維區(qū)域大小用ZEN 2.3 lite軟件進(jìn)行分析，其占左心室的比例用膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)值確定。

2.4 TUNEL染色組織取材同HE染色，按照試劑盒說(shuō)明，石蠟切片，根據(jù)TUNEL染色操作步驟，并滴加DAPI復(fù)染，置入避光暗室中5 min，PBST清洗3次×1 min，封片。置入LSM 800激光共聚焦顯微鏡的40×物鏡鏡頭下觀察，計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)/視野，取5個(gè)不重復(fù)視野/切片。

2.5 免疫組化(immunohistochemistry, IHC)組織取材同HE染色。參照之前的方法[3]，將組織祛除干擾雜質(zhì)后結(jié)合PKD1(1 ∶500稀釋)或HDAC7(1 ∶200)一抗，4 ℃冰箱中放置12 h，重復(fù)PBS沖洗3次×3 min，羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000)標(biāo)記室溫15 min，DAB染色3 min。置入普通顯微鏡的40×物鏡鏡頭下，計(jì)數(shù)5個(gè)不重復(fù)視野染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)的平均值。

2.6 免疫熒光(immunofluorescence, IF)組織取材同HE染色，切片脫蠟后微波處理15 min，PBS沖洗3次×3 min后兔血清封閉切片，加入一抗抗體PKD1(1 ∶50)或HDAC7(1 ∶50)，4 ℃孵育過(guò)夜。d 2取出，PBST沖洗3次×3 min，和Cy3標(biāo)記的熒光二抗共孵育1 h，滴加DAPI復(fù)染，封片。LSM 800激光共聚焦顯微鏡的40×物鏡鏡頭下觀察，ZEN 2.3 lite分析軟件計(jì)算紅藍(lán)熒光比值。

2.7 免疫印跡(Western blot, WB)用RIPA裂解緩沖液(添加蛋白酶抑制劑)浸泡冰箱中凍存的左心室心肌組織，制成組織勻漿后，離心分離提取總蛋白，BCA法確定總蛋白量。每份標(biāo)本取40 μg蛋白行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育PKD1(1 ∶500)或HDAC7(1 ∶100)的一抗抗體，PBS沖洗3次×3 min后和羊抗兔二抗(1 ∶1 000)共孵育，持續(xù)2 h，Odyssey掃描儀掃描蛋白條帶。α-View SA軟件計(jì)算樣本蛋白/GAPDH參照蛋白的值。

3 結(jié)果

3.1 SAB對(duì)MI大鼠組織形態(tài)學(xué)的影響由Fig 1可見(jiàn)，相比Sham組大鼠完整的心肌細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，MI組大鼠心肌組織完整性受到嚴(yán)重破壞，以肉芽和瘢痕組織為主，間雜以殘存的肥大心肌細(xì)胞；SAB治療組大鼠完整的心肌和細(xì)胞較Sham組增多，少見(jiàn)肉芽和瘢痕組織；CID阻斷劑組大鼠心肌組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)和MI組相似。這表明SAB可改善心梗后受損的心肌組織形態(tài)學(xué)。

Fig 1 Effect of PKD1 on histomorphology of MI rats (HE×400)

3.2 SAB對(duì)MI大鼠心肌纖維化的影響由Fig 2可見(jiàn)，Sham組大鼠心肌成分也有少量膠原纖維，呈網(wǎng)狀分布，以紅色心肌纖維為主； MI組大鼠藍(lán)色纖維，膠原占比較Sham組升高(P<0.01)；SAB組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)和Sham組接近，以紅色心肌組織為主，和MI組相比，膠原占比下降(P<0.01)；CID組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)和MI組接近，主要是肉芽和瘢痕組織，和SAB組相比，膠原占比升高(P<0.01)。這表明SAB可減少心梗后受損心肌組織的膠原占比。

3.3 SAB對(duì)MI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響由Fig 3可見(jiàn)，Sham組大鼠心肌組織幾乎全部呈藍(lán)色熒光(示正常心肌細(xì)胞)；MI組大鼠心肌組織中藍(lán)色和紅色熒光(示凋亡細(xì)胞)混合呈現(xiàn)，細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)較Sham組增加(P<0.01)；SAB組大鼠心肌組織中主要呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，間雜少量紅色熒光，細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)較MI組減少(P<0.01)；CID組大鼠心肌組織中藍(lán)色和紅色熒光混合呈現(xiàn)，接近于MI組大鼠，細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)較SAB組增多(P<0.01)。這表明SAB可抑制因心梗后心肌組織受損導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

3.4 SAB對(duì)MI大鼠心肌組織中PKD1和HDAC7蛋白表達(dá)的影響分別應(yīng)用IHC染色(陽(yáng)性表達(dá)蛋白示棕黃色)、IF染色(陽(yáng)性表達(dá)蛋白示紅色熒光)和WB染色(陽(yáng)性表達(dá)蛋白示灰黑色)檢測(cè)心肌組織中PKD1和HDAC7的蛋白表達(dá)。由Fig 4～7可見(jiàn)，三種檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)，均表明:Sham組大鼠的PKD1基礎(chǔ)表達(dá)量較高，HDAC7基礎(chǔ)表達(dá)量很低；與Sham組相比，MI組大鼠PKD1表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而HDAC7表達(dá)和Sham組基本一致；與MI組相比，應(yīng)用了SAB后，PKD1和HDAC7的表達(dá)明顯升高(P<0.01)，也高于Sham組(P<0.01)；CID組和MI組基本一致，PKD1和HDAC7表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量均較SAB組明顯減少(P<0.01)。這表明SAB可上調(diào)心梗后心肌組織內(nèi)PKD1和HDAC7的表達(dá)。

Fig 2 Effect of SAB on myocardial fibrosis in MI rats n=10)

Fig 3 Effect of SAB on cardiomyocyte apoptosis in MI rats n=10)

Fig 4 Effect of SAB on PKD1 and HDAC7 protein expression in myocardium of MI rats

Fig 5 Effect of SAB on PKD1 protein expression in myocardium of MI rats (IF)

Fig 6 Effect of SAB on HDAC7 protein expression in myocardium of MI rats (IF)

Fig 7 Effect of SAB on PKD1 and HDAC7 protein expression in myocardium of MI rats (WB) n=10)

4 討論

本研究大鼠組織形態(tài)學(xué)變化表明，MI組大鼠心肌梗死后缺血壞死的組織由肉芽組織或者瘢痕組織替代，后兩種組織的主要成分為膠原纖維，所以MI組大鼠CVF占比較高；并且心肌缺血受損后除了心肌細(xì)胞壞死外，還伴發(fā)著病理性凋亡，這也解釋了本研究MI組出現(xiàn)紅色熒光的細(xì)胞數(shù)明顯增多的原因。無(wú)論是壞死還是凋亡，心肌細(xì)胞的總量最終都會(huì)減少，又無(wú)法通過(guò)新的再生細(xì)胞的補(bǔ)充，剩余的功能細(xì)胞負(fù)荷加重，心肌細(xì)胞需要肥大來(lái)適應(yīng)這一病理學(xué)進(jìn)程，這是HE染色圖片中出現(xiàn)部分肥大細(xì)胞的原因，和文獻(xiàn)報(bào)道[7]的MI后殘存的心肌組織中有30%的心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大相一致。心肌細(xì)胞壞死、凋亡和病理性肥厚，如果不能采取有效的干預(yù)措施，將會(huì)出現(xiàn)心功能衰竭的嚴(yán)重后果[5, 8]。SAB給藥干預(yù)14 d后，大鼠心肌組織恢復(fù)較好，肉芽或者瘢痕組織明顯減少，CVF占比和凋亡細(xì)胞數(shù)量急劇下降，但這一藥理學(xué)作用可以被CID所阻斷。這表明，SAB可以保護(hù)MI后大鼠缺血損傷的心肌組織，而CID可以抑制SAB的保護(hù)作用。

PKD1和HDAC7的蛋白表達(dá)分別應(yīng)用IHC染色、IF染色和WB染色三種不同方法進(jìn)行檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果保持一致。正常的心肌組織中存在一定量的PKD1表達(dá)，但HDAC7的表達(dá)量很低。PKD1較高的基礎(chǔ)表達(dá)量可能與PKD1本身的生物學(xué)功能和生理學(xué)效應(yīng)比較廣泛，表達(dá)位點(diǎn)較多相關(guān)[9]，HDAC7的基礎(chǔ)表達(dá)量過(guò)低，可能是其正常情況下處于非活化狀態(tài)，需要PKD1激活并遷移至細(xì)胞核中，才能和其發(fā)生生物學(xué)偶合后磷酸化激活而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。MI后受損心肌組織中的PKD1較Sham組減少明顯，這也和心梗心肌的功能部分喪失密切相關(guān)；HDAC7的表達(dá)和Sham組接近，表明損傷并不誘發(fā)HDAC7的表達(dá)上調(diào)。

SAB用藥后，PKD1和HDAC7的表達(dá)均明顯上調(diào)，并且伴隨著缺血心肌組織受損的明顯減輕。之前的研究證實(shí)[5]，PKD1用藥可以改善MI大鼠心肌組織的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，抑制膠原調(diào)控關(guān)聯(lián)蛋白，對(duì)抗心肌纖維化，減輕細(xì)胞凋亡，并能夠?qū)谷毖募〗M織中的產(chǎn)生的過(guò)度炎癥反應(yīng)而保護(hù)心肌組織[8]。同時(shí)，PKD1是參與促血管新生的重要調(diào)控蛋白之一，可以直接上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)毛細(xì)血管的新生，增加缺血心肌的微循環(huán)血供[6, 9-10]。VEGF反過(guò)來(lái)也可以通過(guò)VEGFR2-PKC信號(hào)通路激活PKD1，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)的增殖、遷移和管腔形成[9-10]。PKD1還具有介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)[4]和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma stem cell，MSCs)[11]增殖、遷移和管腔形成的作用，而EPCs和MSCs是誘導(dǎo)內(nèi)源性血管生成的重要的細(xì)胞來(lái)源。HDAC7是PKD1的底物之一，可被VEGF介導(dǎo)的PKD1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激磷酸化激活后，由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)遷移集聚，促進(jìn)ECs的遷移、增殖和微血管的出芽新生[9, 12]。結(jié)合以上文獻(xiàn)報(bào)道和本研究結(jié)果表明，SAB可能通過(guò)調(diào)控PKD1/HDAC7軸在促缺血心肌組織血管新生，增加缺血心肌微循環(huán)血供，保護(hù)受損心肌中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PKD1的特異性阻斷劑CID后，PKD1/HDAC7的表達(dá)明顯下調(diào)。這進(jìn)一步表明，SAB很可能通過(guò)調(diào)控PKD1/HDAC7軸而保護(hù)缺血受損的心肌組織。