(1,3)-β-D-葡聚糖和半乳甘露聚糖抗原檢測侵襲性真菌感染高危兒童的診斷準(zhǔn)確性研究

張明強(qiáng) 趙瑞秋 余國容 許紅梅

通常侵襲性真菌病(IFD)的確診依賴于無菌標(biāo)本培養(yǎng)和組織病理活檢，無菌標(biāo)本培養(yǎng)耗時長、陽性率低；取活體組織進(jìn)行病理學(xué)檢查陽性率亦不高，且是侵襲性操作，由于IFD患者病情重、病變組織深、多有凝血功能障礙等禁忌證，所以常常缺乏可操作性。大部分IFD患者的臨床表現(xiàn)及體征均不典型，尤其是兒科患者，當(dāng)其出現(xiàn)典型表現(xiàn)時，可能疾病已進(jìn)展至晚期或出現(xiàn)播散，此時治療難度大、預(yù)后差。因此，早期診斷、及時治療IFD對改善預(yù)后至關(guān)重要。近年來開展的真菌抗原、抗體及核酸檢測等方法對IFD的早期診斷有重要意義，尤其是抗原檢測如(1,3)-β-D-葡聚糖(BG)檢測(G試驗(yàn))、半乳甘露聚糖(GM)抗原檢測(GM試驗(yàn))[1]。G/GM試驗(yàn)已被納入IFD診斷的微生物依據(jù)，在臨床上應(yīng)用較廣[2]。其在成人患者中研究較多，并有良好的診斷價值，而在兒科中的研究相對較少，且報道的診斷價值不一[3,4]。

本文擬分析重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(我院)兒童IFD的臨床及影像學(xué)特征，探討G/GM試驗(yàn)對兒童IFD的診斷價值，為兒童IFD的早期診斷提供參考。

1 方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 回顧性收集2015年6月至2019年6月在我院住院期間具備IFD危險因素、懷疑真菌感染[5,6]而行血清G試驗(yàn)+GM試驗(yàn)+真菌培養(yǎng)的住院病例。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①入我院前外院已診斷真菌感染或已用抗真菌藥物治療者；②不論出于何種原因，G/GM試驗(yàn)和真菌培養(yǎng)前預(yù)防性應(yīng)用抗真菌藥物治療者；③出院診斷感染不明確者。

1.3 剔除標(biāo)準(zhǔn) 擬診IFD患兒因?yàn)槿鄙傥⑸飿?biāo)本，危險因素和臨床標(biāo)準(zhǔn)特異性差，價值有限，故不納入診斷測試評估[2]。

1.4 IFD危險因素[5,6]①基礎(chǔ)疾病：早產(chǎn)兒、低出生體重兒、先天發(fā)育異常、慢性疾病和重度營養(yǎng)不良等。②原發(fā)性免疫缺陷病。③繼發(fā)性免疫功能低下：抗腫瘤藥物導(dǎo)致外周血中性粒細(xì)胞減少；長期應(yīng)用廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素以及其他免疫抑制劑；骨髓移植和器官移植后以及HIV感染和其他嚴(yán)重病毒感染等。④侵入性操作：包括血管內(nèi)留置導(dǎo)管、留置導(dǎo)尿管、氣管插管或氣管切開、機(jī)械通氣、腹膜透析、血液凈化和胃腸外營養(yǎng)等。⑤既往IFD病史。

1.5 診療常規(guī) 對存在IFD危險因素的患兒常規(guī)同時行影像學(xué)檢查、血培養(yǎng)和G/GM試驗(yàn)，后行經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療，影像學(xué)檢查異常考慮行痰的細(xì)菌和真菌檢測，病原學(xué)結(jié)果明確后對癥治療。

1.6 金標(biāo)準(zhǔn)[5,6]IFD診斷金標(biāo)準(zhǔn)：確診或臨床診斷。①確診標(biāo)準(zhǔn)：無菌標(biāo)本培養(yǎng)為真菌或組織病理學(xué)證實(shí)為真菌；②臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有IFD危險因素、臨床及影像學(xué)表現(xiàn)、≥1項(xiàng)病原學(xué)依據(jù)(合格痰標(biāo)本直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲，連續(xù)>2次培養(yǎng)分離到同種真菌；或支氣管肺泡灌洗液經(jīng)直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲，真菌培養(yǎng)陽性)。

非IFD診斷金標(biāo)準(zhǔn)：未行抗真菌治療情況下抗菌藥物治療有效。

1.7 待測標(biāo)準(zhǔn)及其界值 G試驗(yàn)：采用北京金山MB-80微生物快速檢測系統(tǒng)及(1,3)-β-D葡聚糖檢測試劑盒，≥60 μg·L-1為陽性；GM試驗(yàn)采用Bio-Rad公司生產(chǎn)的試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附法，≥0.5 μg·L-1為陽性。

1.8 IFD 治療轉(zhuǎn)歸[5,6]好轉(zhuǎn)：臨床癥狀和體征、影像學(xué)異常較基線時有所改善或消失，復(fù)查痰液或血液真菌培養(yǎng)陰性。惡化：臨床癥狀和體征較基線時加重或惡化，復(fù)查影像學(xué)出現(xiàn)新發(fā)病灶或原感染病灶加重或擴(kuò)大，復(fù)查痰液或血液真菌培養(yǎng)持續(xù)陽性。

1.9 分組 根據(jù)IFD和非IFD診斷金標(biāo)準(zhǔn)，分為IFD組和非IFD組。IFD組分為確診亞組和臨床診斷亞組，鑒于GM試驗(yàn)對曲霉菌有很高診斷價值，根據(jù)真菌源分為曲霉菌亞組和非曲霉菌亞組。

1.10 統(tǒng)計分析 運(yùn)用Excel軟件及SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果服從正態(tài)分布的資料用xˉ±s表示；非正態(tài)分布資料以中位數(shù)(4分位間距)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計數(shù)資料采用例數(shù)及百分?jǐn)?shù)(%)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，等級資料采用秩和檢驗(yàn)。采用四格表計算G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)診斷IFD的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，繪制受試者特征工作曲線(ROC曲線)并計算曲線下面積(AUC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的164例患兒進(jìn)入分析。IFD組64例，確診亞組24例(37.5%)，臨床診斷亞組40例。男43例(67.2%)，女21例；年齡1 d至15.7歲。均有基礎(chǔ)疾病，包括急性白血病34例，嗜血細(xì)胞綜合征4例，重型地中海貧血2例(1例行造血干細(xì)胞移植)，淋巴瘤2例，再生障礙性貧血1例，顱內(nèi)腫瘤1例，先天性心臟病2例(肺動脈瓣閉鎖1例，室間隔缺損1例)，原發(fā)性免疫缺陷病7例(1例行造血干細(xì)胞移植)，早產(chǎn)兒6例，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)2例，其中1例小腸部分切除術(shù)后，肝移植2例，肝衰竭1例。

非IFD組100例，男53例(53%)，女47例；年齡5月至14.5歲。均有基礎(chǔ)疾病，包括血液腫瘤性疾病84例、原發(fā)免疫缺陷病15例和肝移植1例。

2.2 IFD組真菌菌株分布 IFD組64例培養(yǎng)出64株真菌。

以培養(yǎng)標(biāo)本分類如下：①血及痰液同時培養(yǎng)出白色假絲酵母菌3例，熱帶假絲酵母菌2例；②腦脊液及痰液同時培養(yǎng)出熱帶假絲酵母菌1例；③腦脊液培養(yǎng)出白色假絲酵母菌1例；④骨髓培養(yǎng)馬爾尼菲青霉菌1例；⑤血培養(yǎng)出真菌16例：白色假絲酵母菌5例，熱帶假絲酵母菌4例，光滑球擬酵母菌3例，近平滑假絲酵母菌3例，葡萄牙假絲酵母菌1例；⑥痰培養(yǎng)培養(yǎng)出真菌40例：白色假絲酵母菌18例，熱帶假絲酵母菌6例，光滑球擬酵母菌3例，葡萄牙假絲酵母菌1例，阿沙絲孢酵母菌2例，曲霉菌7例，煙曲霉菌3例。

以培養(yǎng)出的真菌源分類如下：曲霉菌感染10例，其中曲霉菌7例、煙曲霉菌3例；非曲霉菌感染54例，其中白色假絲酵母菌27例、熱帶假絲酵母菌13例、光滑球擬酵母菌6例、近平滑假絲酵母菌3例、葡萄牙假絲酵母菌和阿沙絲孢酵母菌各2例、馬爾尼菲青霉菌1例。

2.3 臨床特征

2.3.1 臨床表現(xiàn) IFD確診亞組患兒24例中，發(fā)熱19例(79.2%)，其中超高熱1例、高熱13例、中度發(fā)熱5例；確診前發(fā)熱時間3～18(8.4±3.9)d；累及肺部6例(咳嗽伴肺部體征4例，咳嗽但無肺部體征2例)。無發(fā)熱表現(xiàn)5例，均為新生兒(其中早產(chǎn)兒4例，小腸部分切除術(shù)后1例)。IFD臨床診斷亞組40例，發(fā)熱38例(95%)，其中超高熱2例、高熱27例、中度發(fā)熱9例，診斷前發(fā)熱時間5～23(10.9±4.8)d；均為肺部感染，咳嗽伴肺部體征20例，咳嗽而無肺部體征16例，無呼吸道癥狀4例。

2.3.2 胸部影像學(xué)表現(xiàn) IFD組中63例行胸部影像學(xué)檢查，1例肝移植患兒未行胸部影像學(xué)檢查，60例(95.2%)有肺部影像學(xué)異常發(fā)現(xiàn)。

54例行胸部CT檢查，非曲霉菌/曲霉菌CT表現(xiàn)：斑片影32(29/3)例、結(jié)節(jié)影22(15/7)例、胸腔積液20(17/3)例、空洞和胸膜增厚各9例(13/5)、暈征6例(4/2)、磨玻璃影4例(4/0)、空氣新月征1例(0/1)；未發(fā)現(xiàn)異常征象2例(2/0)，均為血培養(yǎng)陽性的非曲霉菌感染，其中1例為血液腫瘤性疾病，1例為原發(fā)免疫缺陷病。

9例行胸部X線檢查的患兒均為血培養(yǎng)陽性的非曲霉菌感染(新生兒8例、肝移植1例)，2例發(fā)現(xiàn)肺紋理增多，6例發(fā)現(xiàn)片絮影、團(tuán)片致密影、磨玻璃影或/和實(shí)變，1例X線胸片未見異常。

2.3.3 治療及轉(zhuǎn)歸 64例IFD患兒均予抗真菌治療。10例曲霉菌感染患兒中，使用伏立康唑6例、兩性霉素B 2例，另2例因兩性霉素B不良反應(yīng)(藥疹、急性腎衰竭)改為伏立康唑。54例非曲霉菌感染患兒中，使用伏立康唑10例、氟康唑6例、米卡芬凈11例，使用卡泊芬凈4例、兩性霉素B 10例，因卡泊芬凈或米卡芬凈無效換伏立康唑抗真菌治療8例、換兩性霉素B抗真菌治療4例，因兩性霉素B不良反應(yīng)(尿素氮升高)換為米卡芬凈1例。

治療好轉(zhuǎn)45例(70.3%)，確診亞組17/24例(70.8%)，臨床診斷亞組28/40例(70.0%)；非曲霉菌感染40/54例(74.1%)，曲霉菌感染5/10例(50.0%)。惡化16例(25.0%)，確診亞組6/24例(25.0%)，臨床診斷亞組10/40例(25.0%)；非曲霉菌感染12/54例(22.2%)，曲霉菌感染4/10例(40.0%)。死亡3例(4.7%)，確診亞組1/24例(4.2%)，臨床診斷亞組2/40例(5.0%)；非曲霉菌感染2/54例(3.7%)，曲霉菌感染1/10例(10.0%)。

2.4 G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 IFD組和非IFD組G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)檢測值 表1顯示，IFD組和非IFD組的G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)檢測值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；IFD組確診亞組和臨床診斷亞組G試驗(yàn)檢測值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 IFD組和非IFD組G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)檢測值[中位數(shù)(4分位間距)/μg·L-1]

2.4.2 G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)的敏感度和特異度 G試驗(yàn)包括IFD組和非IFD組病例，GM試驗(yàn)包括IFD組曲霉菌亞組和非IFD組病例。表2顯示，G試驗(yàn)診斷兒童IFD的敏感度68.8%，特異度87.0%；GM試驗(yàn)敏感度80.0%，特異度95.0%，圖1和2顯示，G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)ROC曲線AUC分別為0.79(95%CI：0.72～0.87)和0.92(95%CI：0.82～1.00)。

3 討論

在免疫低下、侵入性操作患兒中，IFD的發(fā)病率及病死率高，傳統(tǒng)確診方法所需時間較長，檢出率低，可能延誤疾病的早期診斷和治療，而早期診斷、及時治療對改善預(yù)后有重要作用[7]。

與成人IFD的臨床表現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促等比較，兒童IFD臨床表現(xiàn)同樣缺乏特異性，尤其在免疫功能低下的患兒中，與細(xì)菌、病毒、分枝桿菌等病原體感染不易區(qū)分。本研究IFD患兒中，發(fā)熱為最常見表現(xiàn)(89.1%)，多為持續(xù)高熱，發(fā)熱持續(xù)時間長，確診前最長發(fā)熱時間23 d，抗細(xì)菌藥物治療無效。肺部為兒童IFD最常見感染部位，IFD組中，95.2%有肺部影像學(xué)異常表現(xiàn)，其中痰培養(yǎng)陽性46例，臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、咳嗽，值得注意的是，少數(shù)并無呼吸道表現(xiàn)并且曲霉菌感染與其他真菌感染臨床表現(xiàn)無明顯差異。因此臨床工作中，輔助檢查如影像學(xué)及G/GM試驗(yàn)對兒童IFD的診斷起至關(guān)重要的作用。

表2 G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)診斷IFD的診斷參數(shù)

圖1 G試驗(yàn)診斷IFD的ROC曲線

圖2 GM試驗(yàn)診斷IFD的ROC曲線

成人IFD中，結(jié)節(jié)影是IFD最常見的CT特征，除此之外，曲霉菌感染較典型的CT特征還有空洞、暈征、空氣新月征等表現(xiàn)[8-10]。在兒童中[11]報道肺部結(jié)節(jié)影依舊占IFD影像學(xué)表現(xiàn)的大部分，暈征、空洞及空氣新月征較少，但仍為兒童曲霉菌感染的特征影像學(xué)表現(xiàn)。本研究中兒童IFD肺部影像學(xué)表現(xiàn)多樣，主要為肺部炎癥表現(xiàn)，以斑片影、結(jié)節(jié)影、胸腔積液常見，且較易累及胸膜腔，與成人相似。其中，曲霉菌感染患兒暈征、空氣新月征檢出率較其他真菌感染患兒高，即暈征、空氣新月征等征象可能更支持曲霉菌感染?；純翰〕讨羞M(jìn)行CT檢查的時間較早有關(guān)。因兒童肺部尚處于發(fā)育階段，代償能力較弱，曲霉菌侵入早期時，破壞血管引起肺部病變，癥狀較成人重，行CT檢查早，晚期出現(xiàn)的空洞、暈征等就相對較少。

傳統(tǒng)診斷方法陽性率低，本研究血培養(yǎng)陽性率僅為32.81%(21/64)。活組織病理學(xué)檢查為金標(biāo)準(zhǔn)之一，但侵入性操作取活檢在高危兒童中風(fēng)險大且非常規(guī)進(jìn)行。因此，血清學(xué)檢查有良好的應(yīng)用前景。G試驗(yàn)在成人IFD中的價值已被證實(shí)，國內(nèi)外學(xué)者[12,13]報道在成人血液疾病或腫瘤疾病患者中，其敏感度為49.6%～56.0%，特異度為90.0%～98.9%。在接受造血干細(xì)胞移植患兒中其敏感度82%，特異度74%[14]；在血液腫瘤性疾病患兒中其敏感度55%，特異度63%[15]。本研究結(jié)果顯示，在IFD高?；純褐蠫試驗(yàn)的敏感度為68.8%、特異度為87.0%，與上述研究中血液和腫瘤疾病患兒基本一致，但敏感度低于接受造血干細(xì)胞移植患兒，考慮可能與不同的儀器平臺、檢測方法和檢測試劑盒有關(guān)。本研究中G試驗(yàn)的ROC曲線AUC為0.79，提示G試驗(yàn)對IFD診斷價值中等。因此在臨床應(yīng)用上需考慮其局限性。Calitri等[16]也認(rèn)為在兒科中，G試驗(yàn)可作為IFD篩查工具，但其價值有限。因?qū)е翯試驗(yàn)假陽性的因素較多，應(yīng)用哌拉西林、透析、血液制品輸注、菌血癥等[17]都可引起G試驗(yàn)假陽性。

GM試驗(yàn)對曲霉菌診斷敏感，且在成人和兒童中診斷價值基本一致，但不適用于其他真菌感染診斷。其在成人免疫抑制患者中敏感度為70%～82%，特異度為82%～84%[18,19]；在兒童血液腫瘤性疾病患者中報道的敏感度為80%～87.5%，特異度為49%～93.3%[15,20-22]。本研究中GM試驗(yàn)敏感度為80.0%，特異度95.0%，與上述報道基本相符，且其ROC曲線AUC為0.92，提示GM試驗(yàn)對兒童曲霉菌感染有較高診斷價值。

本研究IFD組中，非曲霉菌亞組患兒GM陽性7例，其中1例馬爾尼菲青霉菌感染；6例肺部影像學(xué)表現(xiàn)為暈征及空洞2例，空洞及結(jié)節(jié)影1例，暈征及結(jié)節(jié)影1例，胸膜下結(jié)節(jié)影1例，斑片影1例；3例初始使用米卡芬凈抗真菌治療無效，換用伏立康唑抗感染后，臨床好轉(zhuǎn)1例，惡化2例；1例使用氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑聯(lián)合抗真菌治療，病情惡化；1例使用伏立康唑、1例使用兩性霉素B抗真菌治療后好轉(zhuǎn)。

一般情況下，引起GM試驗(yàn)假陽性[5]可能有以下情況：①與其他真菌有交叉反應(yīng)(如馬爾尼菲青霉菌感染等)；②使用半合成青霉素；③食用可能含有GM的牛奶等高蛋白質(zhì)食物和污染的大米等。本研究中，影像學(xué)改變及治療經(jīng)過提示在免疫抑制的狀況下，存在非曲霉菌及曲霉菌合并感染可能，考慮患兒GM陽性可能與此有關(guān)。在非IFD組中GM試驗(yàn)假陽性5例，原因可能與使用抗生素有關(guān)(其中2例使用哌拉西林史，3例有碳青霉烯類使用史)。

綜上所述，G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)對于兒童IFD有一定的輔助診斷價值，但也存在一定局限性。在臨床診斷IFD時，應(yīng)結(jié)合基礎(chǔ)病、免疫狀況、影像學(xué)表現(xiàn)、真菌相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查等綜合評估，早診斷、早治療，以改善預(yù)后。本研究存在一定的局限性，回顧性研究可能存在一定程度的偏倚，確診病例較少，進(jìn)一步可納入需更多病例或設(shè)計多中心前瞻性研究來證實(shí)G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)在兒童IFD中的早期診斷價值。