轉(zhuǎn)RD29A:DREB1A融合基因小麥的獲得及其抗旱性研究

柳 娜，楊文雄，王世紅，張雪婷，楊長(zhǎng)剛

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，甘肅蘭州 730070)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)以及世界范圍內(nèi)最主要的糧食作物。干旱是導(dǎo)致小麥產(chǎn)量減少的最主要環(huán)境因素[1]。通過品種改良提高小麥抗旱能力，增加干旱環(huán)境下的小麥產(chǎn)量對(duì)保證國(guó)家糧食安全具有重要的意義。傳統(tǒng)農(nóng)作物育種存在效率比較低和周期較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)以及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因已經(jīng)越來越多的運(yùn)用于植物的品種改良。與傳統(tǒng)育種相比，轉(zhuǎn)基因技術(shù)針對(duì)性強(qiáng)、效率高，并且所需周期極大地縮短。理論上轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以用于轉(zhuǎn)化任何供體基因組，從而能夠有效地利用不同物種間的優(yōu)良基因[2]。植物能夠通過生理及分子水平的改變適應(yīng)干旱環(huán)境的變化。不同種類的植物誘導(dǎo)不同類型基因的變化來響應(yīng)外界脅迫[3]。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)下游干旱相關(guān)基因介導(dǎo)植物干旱響應(yīng)[4]。干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白質(zhì)(Dehydration-responsive element-binding protein )是一類包含有AP2的DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子[5]。在擬南芥中，DREB1A通過結(jié)合到A/GCCGAC的核心序列，調(diào)控下游基因的表達(dá)，以響應(yīng)干旱、高鹽和冷脅迫[6]。外源擬南芥DREB1A的轉(zhuǎn)基因能夠提高水稻、番茄、小麥等作物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力[1,3,7-9]。目前在小麥遺傳轉(zhuǎn)化過程中，通常采用強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因小麥中表達(dá)。CaMV35S啟動(dòng)子是一種組成性表達(dá)的啟動(dòng)子，因此CaMV35S驅(qū)動(dòng)的基因往往在轉(zhuǎn)基因植物的各個(gè)組織中和不同的生理階段高表達(dá)，而這種持續(xù)性的高表達(dá)往往影響了轉(zhuǎn)基因植物的其他生長(zhǎng)發(fā)育表型，最終導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重影響[3,10-12]。RD29A是一類響應(yīng)干旱以及逆境特異誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，僅僅在干旱或者逆境誘導(dǎo)下特異表達(dá)[13]。利用干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RD29A取代CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DREB1A的表達(dá)，能夠顯著降低外源轉(zhuǎn)基因?qū)χ参锷L(zhǎng)的影響[7]。RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因番茄的生長(zhǎng)發(fā)育沒有受到顯著的影響，但抗旱和抗冷性明顯提高[3]。以上研究說明，用啟動(dòng)子RD29A替代CaMV35S能夠在不嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)的情況下發(fā)揮DREB1A抗旱的作用。然而有關(guān)外源RD29A:DREB1A導(dǎo)入后小麥的抗旱性及產(chǎn)量相關(guān)農(nóng)藝性狀變化的研究目前尚不多見。本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將RD29A:DREB1A導(dǎo)入到小麥品種隴春30中，對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥抗旱生理指標(biāo)進(jìn)行了考察，同時(shí)篩選得到生長(zhǎng)表型正常、抗旱性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株，以期為小麥抗旱分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)荏w材料為甘肅省審定的優(yōu)良品種隴春30。擬南芥所用生態(tài)型為Col-0。受試材料均于甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院抗旱棚下植于塑料盆中。實(shí)驗(yàn)用土取自于大田中的耕層土壤。土壤風(fēng)干后進(jìn)行過篩處理。設(shè)正常水分處理(土壤相對(duì)含水量70%左右)和干旱處理(土壤相對(duì)含水量35%～50%)，選擇生長(zhǎng)一致的盆栽小麥于開花后第3天開始隔日稱重控制水分，干旱期間利用土壤養(yǎng)分，不另施肥。

1.2 啟動(dòng)子和基因克隆引物以及轉(zhuǎn)基因鑒定引物

RD29A啟動(dòng)子為利用RD29A-F：TGTTT AAGGTGGAGAAGCTG以及RD29A-R：ATC TTTTTTTTTGCTTTTTGGAACTCATGTCG引物從擬南芥生態(tài)型Col-0基因組DNA中擴(kuò)增得到。DREB1A序列為利用DREB1A-F:AT GAACTCATTTTCTGCTTT和DREB1A-R:ATAACTCCATAACGATACGT從擬南芥擬南芥生態(tài)型Col-0中cDNA擴(kuò)增所得，引物DREB1A-F:ATGAACTCATTTTCTGCTTT，DREB1A-R:ATAACTCCATAACGATACGT。轉(zhuǎn)基因小麥陽(yáng)性單株P(guān)CR鑒定引物為RD29A-F:TGTTTA AGGTGGAGAAGCTG，載引物為R：GGGTT TCTACAGGACGTAAC。將RD29A啟動(dòng)子序列以及DREB1A基因序列通過同源重組克隆到pBI121載體，同時(shí)將4×MYC標(biāo)簽通過同源重組整合到DREB1A基因序列末端。

1.3 培養(yǎng)基

小麥轉(zhuǎn)基因所用培養(yǎng)基為脫分化培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，詳細(xì)配方參考文獻(xiàn)[14]。

1.4 基因轉(zhuǎn)入方法

利用擬南芥生態(tài)型Col-o基因組DNA和cDNA分別擴(kuò)增獲得RD29A啟動(dòng)子以及DREB1A基因。將構(gòu)建完成的RD29A:DREB1A-4MYC-pBI121質(zhì)粒利用基因槍轉(zhuǎn)化到受體品種隴春30中，并對(duì)后代進(jìn)行分化和篩選。

1.5 Southern印記

利用CTAB法提取3周大小轉(zhuǎn)基因小麥葉片基因組DNA。利用HindⅢ(Takara)過夜消化基因組DNA。消化好的DNA電泳后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Roche)。將標(biāo)記好的探針與尼龍膜孵育并完成雜交后洗脫顯影[15]。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)

利用植物總RNA提取試劑盒(Takara)提取總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(Takara)。熒光定量PCR加測(cè)引物qDREB1A-F:TTCGGTTTCCTCAGGCGGTG，qDREB1A-R:TGTTTGGTTCTCTAACCTCA；ACTIN-F:GT TCCAATCTATGAGGGATACACG， ACTIN-R： GAACCTCCACTGAGAACAA[16]。

1.7 轉(zhuǎn)基因小麥生理指標(biāo)測(cè)定

利用三葉期小麥進(jìn)行干旱處理，干旱處理停止?jié)菜? d后進(jìn)行復(fù)水。對(duì)照和干旱處理材料分別取0.5 g用于生理指標(biāo)分析。脯氨酸含量測(cè)定參考張忠殿等[17]的方法?？扇苄蕴呛繀⒖糎akimi 等[18]的方法提取和測(cè)定。H2O2含量參考Luna等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。MDA含量參考Sairam等[20]的方法進(jìn)行提取和測(cè)定。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性按照Z(yǔ)hang等[21]的方法提取和測(cè)定。所有指標(biāo)測(cè)定均進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 轉(zhuǎn)基因小麥種植及其產(chǎn)量性狀測(cè)定

用T3代純合家系考察轉(zhuǎn)基因小麥產(chǎn)量。對(duì)照和轉(zhuǎn)基因每個(gè)家系分別挑選9株生長(zhǎng)一致的幼苗種植人工氣候室的花盆中。人工氣候室光照強(qiáng)度為500 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間為8:00-18:00，溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為50%±10% 。設(shè)正常水分處理(土壤相對(duì)含水量70%左右)和干旱處理(土壤相對(duì)含水量35%～50%)。選擇生長(zhǎng)一致的盆栽小麥從開花后3 d開始，隔日稱重控制水分，干旱期間利用土壤養(yǎng)分，不另施肥。小麥自然成熟后對(duì)株高、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、千粒重以及地上生物量進(jìn)行考察[22]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用t-test方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 軟件，采用GraphPad Prism8進(jìn)行繪圖。

圖1 轉(zhuǎn)基因再生苗和再生根的培養(yǎng)Fig.1 Culture of transgenic regenerated seedling and regenerated roots

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因小麥鑒定與獲得

將RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)入受體品種隴春30中后，經(jīng)過分化和篩選，共獲得287株再生植株(圖1)。利用RD29A啟動(dòng)子擴(kuò)增引物F端以及MYC的R端引物對(duì)移栽成活T0代轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，T0代轉(zhuǎn)基因材料共有15株檢測(cè)到目標(biāo)條帶。進(jìn)一步通過Southern檢測(cè)，篩選到3株單拷貝插入的T0代轉(zhuǎn)基因小麥，分別命名為L(zhǎng)4、L17和L31(圖2B)。同時(shí)利用RD29A啟動(dòng)子擴(kuò)增引物F端以及載體的R端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)外源基因的插入，結(jié)果顯示，隴春30沒有檢測(cè)到條帶，而L4、L17和L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系均檢測(cè)到外源轉(zhuǎn)基因的插入(圖2C)。為了進(jìn)一步檢測(cè)外源基因是否能夠在轉(zhuǎn)基因小麥中成功表達(dá)，利用MYC抗體對(duì)受體品種隴春30及L4、L17和L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系進(jìn)行了蛋白水平的檢測(cè)，以ACTIN蛋白作為內(nèi)參。在隴春30、L4、L17以及L31中都檢測(cè)到ACTIN蛋白的表達(dá)。而利用MYC抗體檢測(cè)結(jié)果表明，在隴春30中并沒有檢測(cè)到MYC信號(hào)，而L4、L17以及L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系均檢測(cè)到了MYC蛋白的表達(dá)(圖2D)。以上結(jié)果說明，L4、L17以及L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系中DREB1A蛋白能夠成功表達(dá)。

已有研究表明，RD29A啟動(dòng)子是一個(gè)鹽、溫度以及干旱特異誘導(dǎo)的啟動(dòng)子[13]。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證L4、L17以及L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系中RD29A驅(qū)動(dòng)的DREB1A在干旱脅迫下的表達(dá)模式，將L4、L17以及L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系幼苗在人工氣候室進(jìn)行干旱處理，對(duì)DREB1A基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。在干旱處理12 h后，L4、L17以及L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系中，DREB1A都表現(xiàn)出極強(qiáng)的干旱誘導(dǎo)表達(dá)。相比于未干旱處理，干旱脅迫下DREB1A的表達(dá)增強(qiáng)了6～7倍(圖2E)，說明L4、L17以及L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系中，DREB1A基因的表達(dá)受干旱誘導(dǎo)。以上結(jié)果表明，L4、L17以及L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系中RD29A:DREB1A基因成功導(dǎo)入，并且在干旱誘導(dǎo)下能夠成功表達(dá)外源DREB1A蛋白。因此，后續(xù)對(duì)L4、L17以及L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系可進(jìn)一步進(jìn)行純合家系的篩選。

a:RD29A啟動(dòng)子和 DREB1A基因的克隆。B: RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因植株Southern檢測(cè)。箭頭指示為Southern檢測(cè)條帶。C: RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定。D: RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因植株蛋白表達(dá)檢測(cè)。ACTIN作為內(nèi)參。E: RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因植株 DREB1A基因表達(dá)檢測(cè)。ACTIN作為內(nèi)參。正常生長(zhǎng)幼苗作為對(duì)照，對(duì)照表達(dá)量設(shè)定為1。非轉(zhuǎn)基因受體品種隴春30作為對(duì)照(WT)。

2.2 轉(zhuǎn)基因家系純合材料的鑒定

將L4、L17及L31三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系從T1代繁殖得到T2代，利用載體特異引物從T2代中利用PCR鑒定出9株陽(yáng)性單株并繁殖到T3代，再?gòu)腡3代中分別挑取24株幼苗繼續(xù)鑒定，檢測(cè)沒有分離則認(rèn)為該家系為純合家系。利用PCR鑒定方法，分離出L4-3-2、L15-5-7以及L31-4-7三個(gè)轉(zhuǎn)基因純合家系(圖 3)。

1～24代表轉(zhuǎn)基因植物PCR鑒定條帶。M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 轉(zhuǎn)基因小麥的生理抗旱性

2.3.1 轉(zhuǎn)基因小麥的脯氨酸和可溶性糖酸含量對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)

與正常供水對(duì)照相比，在干旱處理下，隴春30及轉(zhuǎn)基因純合家系L4-3-2、L15-5-7和L31-4-7的脯氨酸和可溶性糖含量均顯著增加， 但三個(gè)轉(zhuǎn)基因純合家系的脯氨酸和可溶性糖酸含量的增加幅度要顯著高于隴春30(圖4A和圖4B)，表明轉(zhuǎn)基因家系在干旱脅迫下具有更強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié) 能力。

**表示干旱條件下轉(zhuǎn)基因材料與隴春30差異在0.01水平上顯著(P<0.01)。下圖同。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因小麥的H2O2含量、MDA含量和相對(duì)導(dǎo)電率對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)

在對(duì)照條件下，隴春30及三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系L4-3-2、L15-5-7和L31-4-7間H2O2含量、MDA含量和相對(duì)導(dǎo)電率均相近，差異均較小(圖5)。在干旱脅迫下，隴春30的H2O2含量較對(duì)照提高了近4倍，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系中H2O2含量的提高幅度顯著低于隴春30(圖5A)；隴春30中 MDA含量相對(duì)于對(duì)照提高了約2.5倍，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系的MDA含量提升均不到1.0倍(圖5B)；隴春30中相對(duì)導(dǎo)電率較對(duì)照增加了4倍，達(dá)到20%，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系的相對(duì)導(dǎo)電率雖然也有增加，但增加幅度明顯小于隴春30(圖5C)。這表明在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的活性氧累積較少，膜脂過氧化程度輕，膜透性受干旱脅迫影 響小。

圖5 轉(zhuǎn)基因小麥的H2O2含量、相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量Fig.5 H2O2 content,MDA content and relative electrical conductivity in transgenic wheat

2.3.3 轉(zhuǎn)基因小麥的抗氧化酶活性對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)

在對(duì)照條件下，隴春30及三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系L4-3-2、L15-5-7和L31-4-7間SOD、CAT和POD活性均相當(dāng)(圖6)。在干旱脅迫下，隴春30和三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系的SOD、CAT和POD活性較對(duì)照均顯著提高，但三個(gè)轉(zhuǎn)基因材料的三種酶活性的提高幅度均高于隴春30(圖6)，表明干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥具有更強(qiáng)的活性氧清除能力，有利于適應(yīng)干旱脅迫。

圖6 轉(zhuǎn)基因小麥的SOD、CAT和POD活性Fig.6 Activities of SOD,CAT and POD in transgenic wheat

2.4 轉(zhuǎn)基因小麥產(chǎn)量性狀考察

在對(duì)照條件下，三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系的株高、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、千粒重以及地上生物量較受體品種隴春30均略微降低(表1)。但在干旱脅迫下，所有材料的各指標(biāo)均較對(duì)照有所下降，但相比于隴春30，三個(gè)轉(zhuǎn)基因家系株高、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、千粒重和地上生物量分別增加6%～7%、7%～8%、 10%～12%、9%～12%及9%～12%(表1)，說明RD29A:DREB1A外源基因的導(dǎo)入對(duì)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育影響并不十分明顯，但在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因小麥的農(nóng)藝性狀相比受體隴春30受到的抑制效應(yīng)較小，表現(xiàn)出較好的抗旱能力。

表1 轉(zhuǎn)基因小麥產(chǎn)量性狀考察Table 1 Investigation of yield traits of transgenic wheat

3 討 論

小麥容易受到干旱環(huán)境的影響，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)胄←溸M(jìn)行遺傳改良，能夠極大地加速小麥的育種進(jìn)程。作物的產(chǎn)量是一個(gè)比較復(fù)雜的性狀。作物產(chǎn)量的提高是作物遺傳改良的主要目標(biāo)。在本研究中，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將擬南芥基因RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)入到受體品種隴春30中，篩選獲得抗旱性強(qiáng)、產(chǎn)量高且沒有明顯生長(zhǎng)發(fā)育表型的純合轉(zhuǎn)基因家系，為培育抗旱小麥品種奠定了基礎(chǔ)。

DREB蛋白在提高植物抗逆中起著重要作用[6,12,23-26]。DREB基因能夠明顯提高小麥對(duì)干旱和逆境脅迫的抗性[27-30]。然而由于DREB作為一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，可能通過調(diào)控多個(gè)途徑的基因表達(dá)而參與到其他生物學(xué)過程中，通常利用CaMV35S驅(qū)動(dòng)DREB所得到的轉(zhuǎn)基因植株可能由于過量異位表達(dá)DREB導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)發(fā)育表型受到影響[31]。因此DREB的本底表達(dá)量和干旱脅迫的特異響應(yīng)表達(dá)量對(duì)于利用DREB轉(zhuǎn)基因的作物改良起到非常重要的作用。目前已經(jīng)在多種植物利用特異誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子誘導(dǎo)DREB的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，使得轉(zhuǎn)基因植物抗旱抗逆境脅迫增強(qiáng)，卻不明顯影響植株生長(zhǎng)發(fā)育[3,7,32-33]。轉(zhuǎn)基因植株中 DREB1A蛋白與對(duì)照ACTIN相比，處于較低的水平(圖1D)。而在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的DREB1A轉(zhuǎn)錄受到了強(qiáng)烈的誘導(dǎo)(圖1E)。因此，我們獲得了本底蛋白表達(dá)低、但能夠受到干旱脅迫特異誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。DREB的過量表達(dá)能夠影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，本實(shí)驗(yàn)所獲得的RD29A:DREB1A的轉(zhuǎn)基因小麥由于本底DREB1A表達(dá)不高，生長(zhǎng)發(fā)育沒有受到太大的影響，然而卻能夠特異響應(yīng)干旱脅迫，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。

干旱能夠誘導(dǎo)植物脯氨酸以及可溶性糖的含量的增加[34-35]。植物能夠通過調(diào)整細(xì)胞脯氨酸以及可溶性糖的含量改變細(xì)胞滲透壓，從而適應(yīng)干旱脅迫[36]。因此，脯氨酸以及可溶性糖的含量在植物抗旱過程中起到重要作用。RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因小麥脯氨酸和可溶性糖含量在干旱脅迫下顯著高于野生型，表明RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因小麥在干旱脅迫下具有更強(qiáng)的調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的能力(圖4)。

MDA是細(xì)胞體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的標(biāo)記物[37]。H2O2含量以及MDA含量升高能夠?qū)е录?xì)胞膜的損傷。干旱脅迫處理能夠誘導(dǎo)H2O2以及MDA的含量升高，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷會(huì)引起相對(duì)導(dǎo)電率的變化。 在干旱脅迫下，RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因小麥的H2O2含量、MDA含量和相對(duì)導(dǎo)電率相比野生型都有顯著下降，表明轉(zhuǎn)基因小麥在干旱脅迫下細(xì)胞膜的損傷程度低于野生型(圖5)。

干旱脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平上升[38]?；钚匝醯姆e累對(duì)植物細(xì)胞造成損傷[39]。植物在干旱脅迫下對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧的清理可增強(qiáng)抗旱作用。SOD、CAT和POD在清除細(xì)胞過量活性氧的過程中起到重要作用。RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因小麥的SOD、CAT和POD在干旱脅迫下表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性，說明轉(zhuǎn)基因小麥在干旱脅迫下具有更強(qiáng)的清除活性氧的能力(圖6)。以上結(jié)果表明，在干旱脅迫下RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因小麥通過增強(qiáng)細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力、減少活性氧的含量以及降低細(xì)胞受損程度，從生理水平上更加適應(yīng)干旱脅迫，能夠更好地維持正常細(xì)胞功能。因此，RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因小麥在生理水平表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱能力。

本試驗(yàn)中DREB1A轉(zhuǎn)基因是由特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，然而轉(zhuǎn)基因植株中DREB1A具有一定的本底表達(dá)量，因此導(dǎo)致植株的生長(zhǎng)發(fā)育受到輕微的影響(表1)。已報(bào)道RD29A:DREB1A轉(zhuǎn)基因番茄的生長(zhǎng)表型也受到輕微的影響[3]。但是由于RD29A:DREB1A外源基因受到干旱的特異誘導(dǎo)，因此轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱能力，使產(chǎn)量性狀得到改善。這表明利用RD29A:DREB1A外源基因能夠更好地替代CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子，使得轉(zhuǎn)基因小麥既能提高抗旱能力，又能維持自身正常生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)中，我們利用了擬南芥RD29A:DREB1A外源基因基因?qū)﹄]春30進(jìn)行遺傳改造，所獲得的純合轉(zhuǎn)基因家系在生理水平對(duì)干旱有更強(qiáng)的抗性，同時(shí)能夠改善干旱脅迫下的產(chǎn)量性狀，并且對(duì)植物自身發(fā)育影響較小，為小麥選育抗旱脅迫相關(guān)品種奠定了基礎(chǔ)。

干旱脅迫是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，植物通過多個(gè)基因在不同的層次響應(yīng)干旱脅迫，通過單基因的導(dǎo)入并不能夠完全實(shí)現(xiàn)對(duì)作物抗旱的遺傳改良。因此，需要不斷加深抗旱分子機(jī)理研究，促進(jìn)分子育種發(fā)展以全面、有效地實(shí)現(xiàn)品種改良和 選育。