牡丹花粉生活力測定方法及其貯藏研究進(jìn)展

李 婷， 喬 琦， 李劍峰， 郭幸飛， 侯小改

(河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/牡丹學(xué)院，河南 洛陽 471023)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)系毛茛科芍藥屬多年生木本植物，原產(chǎn)于中國，有極高的觀賞價值和藥用價值，因其栽培歷史悠久，品種繁多，素有“花中之王”“國色天香”之美譽。牡丹根皮又稱牡丹皮、丹皮，是一味應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥。近年發(fā)現(xiàn)，牡丹籽油中包含大量有益人類身體健康的微量元素、高濃度脂肪酸和牡丹黃酮等物質(zhì)，可廣泛應(yīng)用于保健產(chǎn)品、化妝品、飲料及食用油等不同領(lǐng)域[1]。隨著牡丹籽油應(yīng)用價值的發(fā)現(xiàn)，其籽粒的需求量日益增加。但我國油用牡丹普遍表現(xiàn)結(jié)實率低，進(jìn)而嚴(yán)重影響籽粒產(chǎn)量。我國油用牡丹主栽品種之一鳳丹(PaeoniaostiiFeng dan)，其不僅結(jié)實率較低，且廣適性較差，僅分布于我國少數(shù)地區(qū)，迫切需要提高籽粒產(chǎn)量及其適應(yīng)性。前人對牡丹的相關(guān)研究大部分集中在施肥、雜草防控和病蟲害防治方面，在一定程度上提高了牡丹籽粒的產(chǎn)量[2]。雜交育種是提高牡丹結(jié)實率和適應(yīng)性的有效手段，但雜交過程中最大的問題是花期不遇，因為牡丹花期短且集中，不同品種同花期的較少，而通過花粉貯藏可以有效解決花期不遇問題。準(zhǔn)確測定牡丹花粉活力可快速找出高效親本，縮短育種年限，從而加快育種改良速率。鑒于此，從牡丹花粉的采集、花粉活力的測定和花粉貯藏等方面進(jìn)行概述，分析影響牡丹花粉萌發(fā)和貯藏壽命的因素，并提出下一步牡丹花粉貯藏研究的方向，以期為同類研究及牡丹雜交育種提供參考。

1 牡丹花粉的采集

1.1 采集時間

花粉的采集時間是影響花粉活力的重要因素[3]，根據(jù)具體的花蕾發(fā)育形態(tài)和色澤變化特點及時采集花粉，采集過早，則雄蕊未完全成熟，花粉量少且積累的營養(yǎng)物質(zhì)不足，造成花粉活力低下；采集過遲，大部分雄蕊已散粉，影響花粉采集量[4]。因此準(zhǔn)確確定花粉采集時間至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，栽培牡丹的初開期花粉萌發(fā)率最高，為70%～75%；野生牡丹在綻口期采集的花粉萌發(fā)率最高，達(dá)90%；由于大多數(shù)木本植物在中午散粉量最大，因此采粉時間應(yīng)根據(jù)牡丹品種特性，選取相應(yīng)時期的花朵，于10：00至14：00進(jìn)行采集[5]。

1.2 采集方法

牡丹屬多年生木本植物，單花大且花粉量多，其花粉收集通常采用鑷子把花藥摘下，烘干或自然風(fēng)干至花藥開裂、散粉后進(jìn)行收集[6]；如天氣條件不適宜采集花粉情況下，為保證花粉活力，可將田間成熟花枝帶回室內(nèi)進(jìn)行水培至散粉進(jìn)行收集[7]；在運輸途中需注意花粉保鮮，防止失活[8]。

不同時期牡丹花朵采集方法不同。采集牡丹蕾期的花朵，應(yīng)在保鮮條件下帶回實驗室水培養(yǎng)(或營養(yǎng)液培養(yǎng))進(jìn)行自然散粉，收集后的花粉放在室內(nèi)硫酸紙上攤放晾干或烘干[9]。采集綻口期的花朵，直接剝?nèi)』ㄋ帲湃雺|有光滑硫酸紙的培養(yǎng)皿中，保鮮條件下帶回室內(nèi)放入裝有硅膠的干燥器內(nèi)或烘干至花藥開裂后收集花粉[10]。采集牡丹盛花期的花朵，可先用紙袋套在花朵上面，然后輕輕敲打花的莖段，花粉自然脫落于紙袋中[11]。3個時段收集花粉的方法各有優(yōu)缺點，前2種方法均為室內(nèi)采集，其花粉都不是在原株上成熟散粉。第1種室內(nèi)培養(yǎng)花蕾的花粉活力相對偏低，但采集的花粉種類純正，不會摻雜別的花粉；第2種和第3種方法需特別注意要采集處女花，以防昆蟲訪花后帶有其他種類的花粉，可在花朵開放前對其進(jìn)行套袋處理。

2 花粉活力測定方法

花粉活力的高低直接影響雜交育種的結(jié)果，因此在進(jìn)行雜交育種前花粉活力測定是不可或缺的一步，目前牡丹花粉活力測定主要有染色法和離體萌發(fā)測定法。

2.1 染色法

染色法中測定花粉活力最常見的是氯化三苯基四氮唑染色法(TTC法)，氯化三苯基四氮唑即紅四氮唑，是標(biāo)準(zhǔn)的絨化還原色素，水溶液無色，遇到活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶接受氫離子，還原后變紅生成不溶于水的三苯甲胯，呈紅色，故此用來測定花粉活力，有生活力的花粉都會被染成紅色，無活力的呈無色[12]。其優(yōu)點是測定速度快，但TTC法在測定過程中出現(xiàn)過渡色，顏色鑒別有困難，測定結(jié)果往往偏高。其他常見染色法如醋酸洋紅法和I2-KI染色法均不適合牡丹花粉染色，律春燕等[13]用醋酸洋紅法(濃度1%)和I2-KI(濃度5%)分別對黃牡丹花粉染色發(fā)現(xiàn)，醋酸洋紅將花粉全部染成紅色，I2-KI將花粉基本染為黃褐色，兩者均無法判定花粉有無活力。

2.2 離體萌發(fā)測定法

離體萌發(fā)測定法指將花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)，通過觀察其花粉管生長的現(xiàn)象來確定花粉活力的大小[14-15]，檢測效果比較準(zhǔn)確，在顯微鏡下可直觀地區(qū)分出活力較弱、沒有活力和活力較強的花粉，應(yīng)用廣泛，對貯藏花粉和新鮮花粉都適用。離體萌發(fā)測定法培養(yǎng)花粉需要特定的培養(yǎng)基，常用的培養(yǎng)基有液態(tài)和固態(tài)2種，其中以離體萌發(fā)液體培養(yǎng)基法最為簡便。液體培養(yǎng)基法是用毛筆等適宜工具蘸取適量花粉后均勻撒播于載玻片的凹槽內(nèi)，凹槽內(nèi)含有配制好的液體培養(yǎng)基，之后將其放在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，加蓋置于恒溫箱內(nèi)(25±1)℃培養(yǎng)[16-18]。固體培養(yǎng)基法是在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂，其他成份均相同。2種方法都是在一定培養(yǎng)環(huán)境控制下，由離體培養(yǎng)時的萌發(fā)率來判定花粉活力，方法均體現(xiàn)出簡單合理并可定量的優(yōu)點，但離體萌發(fā)測定法應(yīng)用中花粉的萌發(fā)條件對其活力影響較大，如培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)、礦質(zhì)元素、培養(yǎng)溫度與時間等都會影響花粉萌發(fā)率[19]。

3 花粉培養(yǎng)條件

3.1 培養(yǎng)基成分

3.1.1 蔗糖和硼酸 蔗糖和硼酸是花粉培養(yǎng)基的基本成分。蔗糖作為花粉萌發(fā)所需的主要營養(yǎng)物質(zhì)兼顧滲透壓調(diào)節(jié)劑，其濃度大小對花粉萌發(fā)至關(guān)重要，如培養(yǎng)基中蔗糖濃度過高，滲透壓增大，會導(dǎo)致花粉失水而產(chǎn)生質(zhì)壁分離和花粉破裂等現(xiàn)象，從而使花粉萌發(fā)率降低[19-20]。牡丹花粉培養(yǎng)所需的蔗糖質(zhì)量濃度一般在50～200 g/L，具體的質(zhì)量濃度因品種的不同而存在差異[21]，但野生和栽培牡丹花粉培養(yǎng)所需蔗糖質(zhì)量濃度沒有明顯差異[22]。硼酸的作用主要是參與糖分吸收轉(zhuǎn)運和代謝以及果膠質(zhì)的合成等過程，從而促進(jìn)花粉萌發(fā)，牡丹花粉培養(yǎng)所需的硼酸質(zhì)量濃度一般在30～80 mg/L。野生牡丹花粉培養(yǎng)所需硼酸質(zhì)量濃度較栽培牡丹低[22]。不同牡丹品種間花粉培養(yǎng)所需蔗糖和硼酸質(zhì)量濃度不同，黃牡丹花粉培養(yǎng)適宜的質(zhì)量濃度為蔗糖150 g/L、硼酸30 mg/L[13]；黑花魁牡丹花粉適宜培養(yǎng)基為蔗糖50 g/L、硼酸40 mg/L；夜光杯牡丹花粉較理想的培養(yǎng)基為蔗糖50 g/L、硼酸80 mg/L[23]。施江等[24]以12個牡丹品種為研究對象，用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得出較適合牡丹花粉萌發(fā)的蔗糖質(zhì)量濃度為 150 g/L左右，硼酸質(zhì)量濃度為60～80 mg/L。

3.1.2 其他成分 Ca2+可以誘導(dǎo)花粉管產(chǎn)生一定的趨向性，使花粉管朝Ca2+濃度高的方向生長，但外界Ca2+質(zhì)量濃度過高可導(dǎo)致牽引型Ca2+通道受損，從而抑制花粉管生長。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+單獨用于牡丹花粉萌發(fā)時其質(zhì)量濃度在0～200 mg/L作用不明顯，以40 mg/L濃度最佳，高于300 mg/L時抑制萌發(fā)；Ca2+濃度為20 mg/L時與蔗糖、硼酸兩兩組合后對花粉萌發(fā)率有極顯著影響，但三者同時作用卻無顯著差異[13]。

鉀和鎂是構(gòu)成細(xì)胞滲透勢的重要組分，但單獨用于黃牡丹花粉萌發(fā)的作用不顯著，高于300 mg/L時抑制其萌發(fā)[17]。赤霉素為植物生長調(diào)節(jié)劑，對牡丹花粉萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用。試驗發(fā)現(xiàn)，適宜牡丹萌發(fā)的赤霉素質(zhì)量濃度為25～50 mg/L，不同的牡丹品種適宜的赤霉素濃度存在差異[24]。聚乙二醇-6000(PEG-6000)溶于水、甲醇等，其與疏水性分子結(jié)合后的產(chǎn)物可用作非離子表面活性劑。試驗證明，PEG-6000對花粉萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，適宜花粉萌發(fā)的質(zhì)量濃度為150～200 g/L，高于200 g/L時抑制作用明顯[24]。

3.2 培養(yǎng)條件

3.2.1 培養(yǎng)時間 不同品種牡丹花粉萌發(fā)所需時間有明顯差異，研究發(fā)現(xiàn)，野生牡丹品種花粉萌發(fā)時間短于栽培品種，野生牡丹品種花粉萌發(fā)時間一般為7～8 h[5]，而栽培品種一般為8～16 h[25-26]，栽培品種分單瓣品種和重瓣品種，單瓣品種萌發(fā)時間比重瓣品種萌發(fā)時間短且集中[27]。

3.2.2 溫度 適合的溫度有助于花粉萌發(fā)，過高或過低對花粉的萌發(fā)都會產(chǎn)生不利影響?；ǚ叟囵B(yǎng)一般在恒溫培養(yǎng)箱里進(jìn)行，適宜的培養(yǎng)溫度為22～28℃[10]，不同品種牡丹花粉萌發(fā)的適宜溫度無明顯差異[19]。

3.2.3 pH 適宜的pH能增加花粉的透水性，利于花粉孔擴(kuò)張?；ǚ弁獗谀退釅A，內(nèi)壁不耐酸堿，pH過高，其堿性環(huán)境會導(dǎo)致花粉內(nèi)壁溶解；pH過低，其酸性環(huán)境則影響內(nèi)壁軟化效果。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著pH升高，牡丹花粉萌發(fā)率有升高趨勢，當(dāng)pH超過7.5時，花粉萌發(fā)率下降[28]。不同品種間花粉萌發(fā)的適宜pH差異較小，在一定pH范圍內(nèi)楊山牡丹(Paeoniaostii)、紫斑(Paeoniarockii)和卵葉(Paeoniaqiui)牡丹的花粉萌發(fā)率隨著pH升高呈上升趨勢，楊山牡丹花粉在pH 6.5時達(dá)最大值，紫斑(Paeoniarockii)和卵葉牡丹花粉在pH 7.0時達(dá)最大值[26]。綜合看，牡丹花粉離體萌發(fā)較為適宜的pH為6.5～7.5。

4 花粉貯藏

花粉貯藏是解決雜交育種中親本花期不遇現(xiàn)象的重要舉措。影響花粉貯藏壽命的因素除遺傳因素外，環(huán)境因素中貯藏溫度和花粉本身含水量是決定花粉活力持續(xù)時間長短的重要因子[29-31]。

4.1 溫度

貯藏花粉活力的重要影響因素之一是溫度。一般情況下，花粉貯藏壽命隨溫度降低而增加，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[32]，原因是溫度與花粉內(nèi)部的呼吸強度關(guān)系密切，低溫降低呼吸強度，而高溫增加呼吸強度導(dǎo)致花粉營養(yǎng)枯竭，從而降低花粉貯藏壽命[33]。研究表明，牡丹花粉在室溫下(25±1)℃可以貯藏1～2周，4℃條件下可以貯藏90～180 d，在-20℃下可貯藏180～300 d，超低溫保存(低于-70℃)可以貯藏1 a以上，具體貯藏時間因品種而異[34-38]。

4.2 含水量

影響貯藏花粉活力的另一個重要因子是花粉含水量。一定范圍內(nèi)，花粉貯藏壽命隨含水量增加而減少[15,39]?；ǚ酆康停档兔富钚院秃粑饔?，從而延長花粉貯藏壽命,但極干燥條件也不利于花粉保存[39-44]。收獲花粉后進(jìn)行適當(dāng)干燥可避免花粉冷凍過程中的傷害，尤其是超低溫貯藏時，貯藏前要將花粉含水量降低，避免冰凍后結(jié)塊。相關(guān)研究表明，牡丹花粉超低溫保存最適含水量為7%～11%[37]。

4.3 超低溫貯藏后的解凍方式

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超低溫貯藏后花粉活力的高低與解凍方式有關(guān)，尤其是液氮保存后花粉的化凍方式對其活力有顯著影響。尚曉倩[37]研究發(fā)現(xiàn)，芍藥花粉超低溫保存后，30℃溫水浴快速解凍可以保持較高的萌發(fā)率；然而蓋樹鵬等[34]研究認(rèn)為，牡丹花粉超低溫保存后用自來水沖洗解凍效果最好。

5 小結(jié)與展望

牡丹花粉活力測定應(yīng)采用花粉離體萌發(fā)法，此法簡單準(zhǔn)確，可直觀判定花粉的活力。染色法雖然迅速，但其染色劑除能使正?；ǚ壑庖材苁刮闯墒?、衰老和敗育的花粉著色，最后花粉活力測定值往往偏高[45-47]。花粉貯藏時應(yīng)選擇合適的貯藏溫度和花粉含水量，低溫和相對干燥的條件對花粉的貯藏有利，但各個溫度條件下花粉貯藏的最適含水量研究較少，干燥程度不確定，無法大幅度提高花粉的貯藏壽命，明確花粉干燥程度或含水量范圍是下一步需要解決的問題。在其他植物花粉貯藏研究中發(fā)現(xiàn)，CO2氣體中貯藏的花粉壽命延長，2×104Pa條件下可貯藏9 d；在O2氣體中貯藏，花粉壽命縮短[48]。然而目前極少有對牡丹花粉在CO2、N2及O2等氣體介質(zhì)中和不同壓強下的貯藏研究，這將是牡丹花粉活力貯藏研究的一個方向，同時貯藏后花粉萌發(fā)的溫度選擇又是花粉活力貯藏研究的一個重要內(nèi)容。

在牡丹雜交育種特別是利用花期差異雜交育種中，需要清楚所選親本的花期是否相遇，對花期不遇的親本需清楚錯期天數(shù)才能更好地選擇花粉保存方式。選擇花期差異較大的牡丹親本進(jìn)行雜交易獲得優(yōu)異新種質(zhì)，也可通過牡丹的近緣種如芍藥雜交創(chuàng)造變異，育成新品種。一般牡丹早開品種比晚開品種提前14～19 d開花，牡丹晚開品種比芍藥早開品種提前7～15 d開花?；ǚ圪A藏在牡丹育種中解決了花期不遇的問題，而牡丹花粉活力研究和牡丹花期調(diào)查對人工授粉具有重要指導(dǎo)意義，加大對花粉活力的研究力度，將對牡丹育種產(chǎn)生巨大的推進(jìn)作用，進(jìn)一步促進(jìn)該新型油料作物的推廣普及。