魚類性別調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

韓 ，藺佳文，韓 英

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

脊椎動(dòng)物的性別決定機(jī)制包括基因性別決定機(jī)制（genetic sex determination，GSD）、環(huán)境性別決定機(jī)制（environmental sex determination，ESD）和基因-溫度性別決定機(jī)制（genetic sex determination+temperature effect，GSD+TE）［1］。由于進(jìn)化水平的不同，其性別決定機(jī)制不同。遺傳性別決定機(jī)制一般為進(jìn)化程度較高的動(dòng)物，如鳥類、哺乳動(dòng)物等；而爬行類等較低等的脊椎動(dòng)物，則是環(huán)境性別決定機(jī)制的代表；魚類受基因、環(huán)境兩種決定機(jī)制的影響，多數(shù)為基因-溫度性別決定機(jī)制。

1 脊椎動(dòng)物的性別決定機(jī)制

1.1 基因性別決定機(jī)制

基因性別決定機(jī)制是指動(dòng)物的性別分化方向不受外部環(huán)境因素的影響，由性染色體上的遺傳基因來(lái)決定。性別決定基因本身不參與性別的分化，只能控制其“決定過(guò)程”，并且啟動(dòng)一系列性別分化事件［2］?；蛐詣e決定過(guò)程是一系列相互作用的復(fù)雜生化過(guò)程，該過(guò)程最終引起性細(xì)胞的決定和分化，途徑內(nèi)的某些成分或成分組合可能成為影響性別決定方向的主導(dǎo)因素。在大多數(shù)兩性魚類上也類似，性別決定過(guò)程通常是由性染色體上的單基因或者是多基因引起的一系列級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，誘導(dǎo)原始生殖性腺分化［3］。單基因是指動(dòng)物的性別是由位于某條特定的染色體上的單個(gè)基因決定的，其他遺傳基因座不會(huì)覆蓋其影響；多基因是指由基因組中涉及性別決定的所有遺傳因素共同參與了性別決定分化，位于同一染色體上或聚集在同一個(gè)基因座上［4］。此類作用機(jī)制同樣存在于魚類中。

鳥類和哺乳類等進(jìn)化程度較高的脊椎動(dòng)物，其性別決定機(jī)制就屬于基因性別決定機(jī)制?；蛐詣e決定機(jī)制分為兩種：1）雌性同配（XX），雄性異配（XY），如哺乳類；2）雌性異配（ZW），雄性同配（ZZ），如鳥類（平胸類除外）。魚類的性別決定機(jī)制原始、復(fù)雜，不同種類間的染色體類型存在很大差異，常采用基因標(biāo)記法、人工雌核發(fā)育、誘發(fā)性逆轉(zhuǎn)等細(xì)胞學(xué)以外的方法確定性別類型。魚類的基因性別決定機(jī)制大致分為五類：雄性異配型（XY），大多數(shù)魚類性染色體屬于此類型，如虹鱒（Oncorhynchusmykiss）、胡子鯰（Clarias fuscus）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）等；雌性異配型（ZW），如半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）、劍尾魚（Xiphophorus helleri）、大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）；雄性配子異配型（XX／XO），某一個(gè)性別少一條性染色體的魚類，如褶胸魚（Sternoptyx diaphana）；雌性配子異配型（ZO／ZZ），如短頜鱭（Coilia brachygnathus）；復(fù) 性 染 色 體 型（X1X1X2X2／X1X2Y），目前僅在魚類中發(fā)現(xiàn)此類型，如花鰍（Cobitis taenia Linnaeus）等；常染色體型，如斑馬魚（Danio rerio）。

1.2 環(huán)境性別決定機(jī)制

低等的脊椎動(dòng)物進(jìn)化程度低，性別決定方式具有多樣性。一些低等動(dòng)物雌雄兩種性別中的性染色體幾乎沒(méi)有差異性，有的甚至沒(méi)能進(jìn)化出所謂的性染色體，無(wú)法進(jìn)行性別決定。因此在早期胚胎發(fā)育的過(guò)程中，溫度或營(yíng)養(yǎng)狀況等外界環(huán)境因子的改變完全地覆蓋或者取代了遺傳因素的作用，成為性別決定和分化的重要影響因素［4］。在眾多環(huán)境因子中，溫度依賴型性別決定機(jī)制（temperature-dependent sex determination，TSD）最常見(jiàn)。溫度依賴型性別決定機(jī)制是指環(huán)境溫度在一定程度上可以影響動(dòng)物的性別分化方向，一些爬行類如美洲短吻鱷、兩棲類、魚類如白氏銀漢魚（Atherina bleekeri Günther）就屬于這種性別決定機(jī)制。TSD主要分為三種模式：第一種是FM模式，低溫產(chǎn)生雌性后代，高溫產(chǎn)生雄性后代，即Ⅰa型；第二種是MF模式，低溫產(chǎn)生雄性后代，高溫產(chǎn)生雌性后代，即Ⅰb型；第三種是FMF模式，高溫和低溫均產(chǎn)生雌性后代，中間溫度產(chǎn)生雄性后代，即Ⅱ型［5］。例如，美洲短吻鱷卵在33℃下100%孵化為雄性，在30℃以下則雌性比例更高；烏龜卵孵化溫度在20～27℃為雄性，在30～35℃為雌性［6］。

1.3 基因-溫度性別決定

魚類性別除了受性染色體上dmy基因、dmrt1、sf1、amh等常染色體上性別決定基因控制外，外界環(huán)境的影響也很大。其中溫度性別決定機(jī)制（TSD）在環(huán)境因素影響中起重要作用。有試驗(yàn)證據(jù)的魚類中僅有40種屬于TSD型，其余19種魚類為基因-溫度性別決定機(jī)制（GSD+TE）［7］。魚卵在孵化的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)特殊時(shí)期，稱為溫度敏感期（temperature sensitive period，TSP），在溫度敏感期人為升高或降低溫度可忽略遺傳因素的影響改變性別分化方向和性別比例，甚至還會(huì)出現(xiàn)性別逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。例如，尼羅羅非魚在受精9 d后進(jìn)入溫度敏感期。在此期間進(jìn)行高溫36℃處理，一定比例的遺傳性雌魚會(huì)逆轉(zhuǎn)為生理性雄魚。經(jīng)VASA免疫組織化學(xué)染色顯示，高溫處理的尼羅羅非魚性腺在受精后21～39 d由卵巢型變?yōu)椴G丸型；在受精后99 d高溫處理的遺傳性雌魚的性腺變?yōu)檎娌G丸［8］。牙鲆（Paralichthys olivaceus）的溫度敏感期為受精后30～100 d，研究表明，在此期間進(jìn)行27℃高溫處理，雌魚100%性逆轉(zhuǎn)為雄魚，性逆轉(zhuǎn)雄魚的性腺Cyp19a1a基因表達(dá)受到抑制［9］。泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）在20℃溫度下進(jìn)行正常的性腺分化，雌雄比例為1∶1；在25～30℃高溫處理下，80%發(fā)育為雄性。許氏平鲉（Sebastes schlegelii）在溫度較高時(shí)性腺偏雌性發(fā)育；反之性腺偏雄性發(fā)育［10］。

2 環(huán)境對(duì)魚類性別決定的影響

相對(duì)于進(jìn)化程度較高的脊椎動(dòng)物穩(wěn)定的性別決定系統(tǒng)，魚類的性別決定更加靈活。魚類的性別決定系統(tǒng)是以遺傳為基礎(chǔ)的，同時(shí)受環(huán)境因子的影響。這些環(huán)境因子包括生物和非生物兩種因素。生物因素包括病原體等；而非生物因素則為水溫、光照強(qiáng)度、外源激素、氧氣含量、pH值等。這些環(huán)境因素都能在不同程度上影響魚類的性別分化，其中溫度和外源激素是目前最受關(guān)注且影響范圍較廣的兩種環(huán)境因子，尤其在魚類性別決定和分化的關(guān)鍵時(shí)期具有十分顯著的作用。

2.1 溫度對(duì)魚類性別決定的影響

銀漢魚的性別分化遵循一種完全溫度依賴型性別決定機(jī)制（TSD），高溫下雄性比例大，而低溫下雌性比例大。此外，大多數(shù)魚類為基因-溫度性別決定機(jī)制（GSD+TE），是在基因調(diào)控的基礎(chǔ)上，改變環(huán)境溫度使其中一部分性別分化方向發(fā)生改變。尼羅羅非魚的性別決定系統(tǒng)主要是XX／XY，但是當(dāng)在其溫度敏感期進(jìn)行高溫36℃處理時(shí)，XX雌性羅非魚會(huì)性逆轉(zhuǎn)為生理性雄魚，且無(wú)論溫度進(jìn)一步升高還是低溫誘導(dǎo)，都不會(huì)進(jìn)一步增加雄魚比例。有研究證明，尼羅羅非魚的溫度敏感性為一種可遺傳的性狀［11］。在莫桑比克羅非魚（Oreochromismossambicus）的溫度敏感期進(jìn)行20℃低溫處理，會(huì)導(dǎo)致XY雄魚逆轉(zhuǎn)為生理性雌魚。這說(shuō)明不同種類的魚對(duì)溫度的敏感度不同。

2.2 類固醇激素對(duì)魚類性別決定與分化的影響

性類固醇激素是影響魚類性別決定與分化的首發(fā)因素之一，在雄魚中指的是以睪酮為主的雄激素，在雌魚中主要指的是雌激素和孕激素，它們影響生殖細(xì)胞及其他細(xì)胞的發(fā)育，參與性分化器官和第二性征的出現(xiàn)。內(nèi)源性類固醇激素對(duì)魚類性別分化影響存在著兩種假說(shuō)［4］；第一種是1987年由Bogart提出的平衡假說(shuō)。該假說(shuō)是指早期魚體內(nèi)雌雄激素比例決定魚類性別，雌激素水平高則發(fā)育為雌性，反之則發(fā)育為雄性。研究表明，用40μg／g的17β-雌二醇處理出膜后3～20 d的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco），雌性率達(dá)到100%；用20 mg／kg的雌二醇處理出膜10 d后的黃顙魚，雌性率達(dá)到83.6%［12］。另一種是缺失假說(shuō)，即雌激素在魚類性別分化中起關(guān)鍵性作用，若在魚類性別分化關(guān)鍵時(shí)期有雌激素的合成，則為雌性，反之為雄性。例如，編碼類固醇生成酶17β-羥基類固醇脫氫酶1（Hsd17b1）基因的錯(cuò)義SNP與梭魚的ZZ／ZW 性別決定完全相關(guān)，Hsd17b1 mRNA在梭魚未分化性腺和分化性腺中呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)，而W 型mRNA僅在基因型雌性性腺中表達(dá)，所以Hsd17b1等位基因的組合通過(guò)調(diào)節(jié)梭魚的內(nèi)源性雌激素水平來(lái) 決 定 性別［13］。此外，cyp19a1a、3β-hsd、P450scc、P450c17等雌激素合成相關(guān)基因在雄魚苗內(nèi)不表達(dá)，僅在雌魚苗中表達(dá)。由此可見(jiàn)，在魚類早期性別分化過(guò)程中首先出現(xiàn)雌激素，并且雄魚體內(nèi)沒(méi)合成類固醇激素。

3 魚類性別逆轉(zhuǎn)研究現(xiàn)狀

動(dòng)物個(gè)體性別相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象稱為性逆轉(zhuǎn)，又稱為性反轉(zhuǎn)。脊椎動(dòng)物中性逆轉(zhuǎn)被認(rèn)為是基因型和表型的錯(cuò)配，在魚類的個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中溫度、外源激素以及行為等均會(huì)影響魚類的性別分化，使遺傳性別發(fā)生逆轉(zhuǎn)［4］。由于一些魚類雌雄同體，魚類中存在天然性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。先為雌性，即第一性成熟為雌性的卵巢，之后逆轉(zhuǎn)為雄性的精巢，稱為“首雌特征”，如石斑魚類等；先為雄性，具有精巢組織，然后轉(zhuǎn)變?yōu)榇菩月殉玻Q為“首雌特征”，如海產(chǎn)鯛科魚類。雌雄異體的魚類有些也會(huì)自然地發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，當(dāng)前研究認(rèn)為，斑馬魚性腺早期均為不成熟的卵巢，在受精后25～60 d內(nèi)，雄性通過(guò)凋亡基因控制使卵巢凋亡并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為睪丸，而雌性則通過(guò)抗凋亡基因途徑來(lái)抑制凋亡［14］。隨著現(xiàn)代育種技術(shù)的發(fā)展，可以利用外源因素人工誘導(dǎo)魚類性逆轉(zhuǎn)，將遺傳性雄魚誘導(dǎo)為生理性雌魚或遺傳性雌魚誘導(dǎo)為生理性雄魚，如在30 d牙鲆的飼料中添加10μg／g 17α-甲基睪酮70 d，雌魚成功發(fā)生性逆轉(zhuǎn)［9］。

3.1 誘導(dǎo)雄魚性逆轉(zhuǎn)研究

目前主要利用外源性雌激素來(lái)誘導(dǎo)雌魚性逆轉(zhuǎn)。常用的外源性雌激素有雌酮E1（Oestrone）、17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）、17α-乙炔基雌二醇（17α-ethinyl estradiol）、EBA（Oestradiol butyryl acetate）、EB（Oestradiol benzoate）、乙烯雌酚DES（Stilbestrol）等。例如，雄性尼羅羅非魚在17α-乙炔基雌二醇誘導(dǎo)下會(huì)發(fā)生完全性逆轉(zhuǎn)。外源激素的使用方法分為急性方法和慢性方法兩種。急性方法包括注射（肌肉或體腔）、投喂、浸泡或者混合使用；慢性方法包括飼料添加、制成膠囊或顆粒藥物、埋植法等。每種方法均有優(yōu)缺點(diǎn)，針對(duì)魚類及外源激素類型決定。在魚類性別決定早期進(jìn)行外源激素的處理，可以誘導(dǎo)表型性別永久逆轉(zhuǎn)。這個(gè)性別決定永久轉(zhuǎn)換時(shí)期，稱為性別敏感期。在對(duì)外源激素的敏感程度上，生理學(xué)性腺分化期最敏感，組織學(xué)性腺分化期次之。性別敏感期過(guò)后雄魚會(huì)產(chǎn)生雄激素。因此，在利用外源激素誘導(dǎo)雄魚性逆轉(zhuǎn)時(shí)要掌握好性別敏感期，提高性逆轉(zhuǎn)比例［15］。

3.2 誘導(dǎo)雌性性逆轉(zhuǎn)的研究

雄激素可以使雌魚發(fā)生性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。雌性虹鱒在雄激素處理后可以性逆轉(zhuǎn)為雄性；尼羅羅非魚、斑馬魚、大鱗大麻哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）等甚至可以達(dá)到100%雄性率。常用的誘導(dǎo)雌魚性逆轉(zhuǎn)的雄激素類藥物有17α-甲基睪酮（17α-methyltestosterone，MT）、17α-乙炔基睪酮（17α-ethinyl testosterone）和雄烯二酮（androstenedione）、11-KT（11-Ketotestosterone）、T（Testosterone）等。利用50μg／g MT處理雌性羅非魚后100%逆轉(zhuǎn)為雄性；用400μg／L MT處理孵化期的大鱗大麻哈魚，也可以得到100%的轉(zhuǎn)化率［16］。雌激素是誘導(dǎo)卵巢發(fā)育的重要因素，雌雄反轉(zhuǎn)與雌激素水平的降低有著密不可分的關(guān)系。芳香化酶催化雄激素轉(zhuǎn)化產(chǎn)生雌激素，在硬骨魚類性腺分化中起重要作用，因此經(jīng)常利用芳香化酶抑制劑來(lái)誘導(dǎo)雌魚性逆轉(zhuǎn)。芳香化酶抑制劑分為以下幾種：雄烯二酮衍生物，如睪酮等；三唑衍生物，來(lái)曲唑（Letrozole）等；使用含有500μg／g法曲唑（Fadrozole）的飼料飼喂三斑海豬魚（Halichoeres trimaculatus）雌魚，飼喂5 d后卵巢發(fā)育異常，飼喂10 d后全部轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌?。芳香化酶抑制劑還可以使已經(jīng)完成性腺分化的成年魚發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，但是處理時(shí)間較長(zhǎng)，如青鳉魚等。常用的芳香化酶檢測(cè)的方法有酶活性分析法、原位雜交法、RT-PCR和免疫組化法等。

3.3 性逆轉(zhuǎn)與分子生物學(xué)研究

RNA-seq隨著技術(shù)的成熟和功能的強(qiáng)大，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于魚類轉(zhuǎn)錄組研究中。F.Y.Sun［17］等通過(guò)RNA-seq技術(shù)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）的精巢進(jìn)行分析，共計(jì)鑒定出約25 307個(gè)功能基因，其中有167個(gè)為首次在斑點(diǎn)叉尾鮰中鑒定到的基因。在對(duì)精巢和卵巢的轉(zhuǎn)錄本分析中發(fā)現(xiàn)，Sox9、Dmrta2、Amh等為性腺發(fā)生、精巢的發(fā)育和精子發(fā)生的雄性偏向基因。在對(duì)密西西比鏟鱘（Scaphirhynchus platorynchus）性腺的研究中發(fā)現(xiàn)，Dkk1和Dact1是僅存在于卵巢中的性別特異性基因，可以作為密西西比鏟鱘性別分化和性腺發(fā)育研究中的性別標(biāo)記。為了探究ERK和JNK兩個(gè)MAPK家族中的兩個(gè)主要亞族在黃鱔雌雄發(fā)育中的表達(dá)和定位，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡雜交技術(shù)和免疫組織化學(xué)法對(duì)ERK和JNK進(jìn)行檢測(cè)。蛋白免疫印跡雜交結(jié)果顯示，JNK的表達(dá)量低于ERK，ERK在黃鱔的雌雄性腺中均強(qiáng)表達(dá)。相比于精巢組織，JNK1在卵巢中表達(dá)更強(qiáng)，JNK2則在精巢、卵巢組織中表達(dá)差異不顯著。免疫組織化學(xué)的研究結(jié)果顯示，在精原細(xì)胞和卵原細(xì)胞中ERK和JNK呈陽(yáng)性反應(yīng)且定位類似；細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核核質(zhì)呈陽(yáng)性反應(yīng)，核仁呈陰性反應(yīng)。ERK和JNK在卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的陽(yáng)性反應(yīng)隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟逐漸減退。該研究表明ERK和JNK在黃鱔的卵巢發(fā)育和凋亡，雄性發(fā)育的啟動(dòng)過(guò)程中具有重要作用［18］。Cyp19a1a是硬骨魚中產(chǎn)生17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）的關(guān)鍵基因。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法和雙熒光素酶測(cè)定法研究發(fā)現(xiàn)，Cyp19a1a在卵巢中的表達(dá)高于精巢。首次鑒定了一個(gè)miRNA，命名為360miR-26a-5p，研究表明它通過(guò)與Cyp19a1a直接進(jìn)行相互作用，對(duì)E2進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)篩選出了在性逆轉(zhuǎn)高表達(dá)量的miRNA候選基因［19］。

4 總結(jié)

隨著對(duì)魚類性別調(diào)控機(jī)制、性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象和分子生物學(xué)的研究，人們對(duì)魚類性逆轉(zhuǎn)也有了許多新的認(rèn)識(shí)。魚類性別調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，性逆轉(zhuǎn)的影響因素也是多方面的。目前誘導(dǎo)魚類性逆轉(zhuǎn)的方法很多，但是有些理論基礎(chǔ)仍然欠缺，許多方法仍然處于試驗(yàn)階段，并不能大規(guī)模投入生產(chǎn)。筆者認(rèn)為，魚類性逆轉(zhuǎn)的研究方向應(yīng)集中在外源激素對(duì)魚類性逆轉(zhuǎn)的最佳誘導(dǎo)時(shí)期、利用模擬生態(tài)條件對(duì)魚類性逆轉(zhuǎn)進(jìn)行調(diào)控、運(yùn)用現(xiàn)在分子生物學(xué)技術(shù)探究有關(guān)魚類繁殖和性逆轉(zhuǎn)基因及作用途徑，從而進(jìn)一步研究魚類性別調(diào)控機(jī)制和誘導(dǎo)魚類性逆轉(zhuǎn)方法。