文山州獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)問(wèn)題及對(duì)策

李碧鳳 趙敏 張紹衛(wèi) 袁正春

（云南省文山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 663000）

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是近幾十年來(lái)發(fā)展和普及最迅速的分子生物學(xué)新技術(shù)之一[1]，其已發(fā)展為成熟的病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一。自1985 年P(guān)CR 技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，PCR 技術(shù)不僅對(duì)世界生物醫(yī)學(xué)的研究有巨大推動(dòng)作用，而且在獸醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用及基層獸醫(yī)生產(chǎn)實(shí)踐檢測(cè)工作方面也發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。文山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心于2017 年建成獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，中心獸醫(yī)人員缺乏分子生物學(xué)技術(shù)相關(guān)知識(shí)，且基層獸醫(yī)人員工作內(nèi)容復(fù)雜，學(xué)習(xí)交流圈子窄、信息閉塞，對(duì)分子生物學(xué)PCR 檢測(cè)技術(shù)原理及其在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用認(rèn)識(shí)有限。因此，全面分析總結(jié)2017～2019 年文山州獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員在應(yīng)用PCR 檢測(cè)方法中檢（監(jiān)）測(cè)樣品、儀器設(shè)備的使用、檢測(cè)技術(shù)人員及實(shí)驗(yàn)室生物安全等方面存在的問(wèn)題，并提出實(shí)際有效的對(duì)策與措施，以期為基層獸醫(yī)更好地運(yùn)用PCR 檢測(cè)技術(shù)開(kāi)展基層動(dòng)物疫病防控工作提供一些參考。

1 文山州獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室及PCR 應(yīng)用概況

根據(jù)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》，動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)按照國(guó)務(wù)院獸醫(yī)主管部門(mén)的規(guī)定，對(duì)動(dòng)物疫病的發(fā)生、流行等情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。地市一級(jí)的動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)是執(zhí)行重大動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)的一線(xiàn)主體，其獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)著動(dòng)物疫病診斷、檢測(cè)、動(dòng)物免疫狀況調(diào)查、監(jiān)測(cè)等工作，是動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)的技術(shù)保障與根基。隨著國(guó)家對(duì)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)投資力度的加大，文山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心于2017 年在云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心的協(xié)助和技術(shù)指導(dǎo)下，文山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室建成并投入使用。文山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室是文山壯族苗族自治州唯一一個(gè)具有PCR 病原學(xué)檢測(cè)、監(jiān)測(cè)技術(shù)能力的實(shí)驗(yàn)室。獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用PCR 技術(shù)建立了符合當(dāng)?shù)馗咧虏⌒郧萘鞲胁≡瓩z測(cè)、監(jiān)測(cè)的PCR 檢測(cè)方法，并建立了文山州高致病性禽流感監(jiān)測(cè)預(yù)警體系[2]，在2017～2019 年成功控制和處置了文山州區(qū)域內(nèi)的H7N9亞型禽流感及其他重大動(dòng)物疫情。

文山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)，為文山州動(dòng)物疫病的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)技術(shù)從血清學(xué)抗體檢測(cè)逐步向病原學(xué)PCR 檢測(cè)技術(shù)方向發(fā)展提供了基礎(chǔ)平臺(tái)。于2018年中心實(shí)驗(yàn)室因?qū)嶋H病原學(xué)檢測(cè)與監(jiān)測(cè)工作的需求，新購(gòu)入一臺(tái)PCR 儀。2019 年因非洲豬瘟疫情的爆發(fā)，檢測(cè)樣品數(shù)量的劇增購(gòu)入一臺(tái)全自動(dòng)核酸提取儀；先進(jìn)儀器設(shè)備的補(bǔ)充，促進(jìn)了文山州獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室高致病性禽流感、非洲豬瘟、新城疫、豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳、口蹄疫、小反芻獸疫等病原學(xué)PCR 檢測(cè)、監(jiān)測(cè)工作的快速開(kāi)展。2017～2019 年獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用PCR 技術(shù)開(kāi)展文山州活禽交易市場(chǎng)、規(guī)模養(yǎng)禽場(chǎng)以及預(yù)警監(jiān)測(cè)點(diǎn)的禽流感監(jiān)測(cè)，全面掌握全州禽流感疫情動(dòng)態(tài)，做到底子清、情況明，為全州禽流感的疫情防控提供有效手段，有效阻斷大規(guī)模禽流感疫情的爆發(fā)。同時(shí)對(duì)豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳、口蹄疫、小反芻獸疫等疫病開(kāi)展緊急P(pán)CR 檢測(cè)與集中PCR 病原學(xué)監(jiān)測(cè)，為文山州動(dòng)物疫控中心開(kāi)展重大動(dòng)物疫病防控決策提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因非洲豬瘟爆發(fā)，2019 年病原學(xué)檢測(cè)、監(jiān)測(cè)工作在新增儀器的有效運(yùn)轉(zhuǎn)下，完成大批量ASF 樣品PCR 檢測(cè)，為基層獸醫(yī)及時(shí)檢測(cè)診斷非洲豬瘟可疑樣品、快速采取非洲豬瘟防控措施提供了科學(xué)技術(shù)支持。

2 應(yīng)用PCR 檢測(cè)方法存在的問(wèn)題

2.1 PCR 檢（監(jiān)）測(cè)樣品

在PCR 樣品品質(zhì)問(wèn)題。高致病性禽流感、新城疫病原學(xué)的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)，其樣品主要采集禽類(lèi)的咽喉、泄殖腔、環(huán)境、運(yùn)輸工具棉拭子，基層獸醫(yī)人員對(duì)采集棉拭子所需的保存液的配制及加入多少在實(shí)際操作中存在許多問(wèn)題。很多基層獸醫(yī)人員為了方便工作省去保存液的滅菌步驟；有的樣品里無(wú)保存液；有的則加入保存液的量只夠棉拭子吸取無(wú)法用于核酸提?。欢杉須夤芙M織樣品時(shí)又出現(xiàn)只見(jiàn)喉頭不見(jiàn)氣管或只見(jiàn)氣管不見(jiàn)喉頭；以及樣品腐敗變質(zhì)、盛放隨意等問(wèn)題。豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病檢測(cè)、監(jiān)測(cè)的樣品大多采集全血或脾肺或扁桃體，這在基層常出現(xiàn)采集的是血清不是全血；采集全血的試管因保存不當(dāng)而破裂；采集的組織太大或太小不符合要求。非洲豬瘟檢測(cè)與監(jiān)測(cè)的樣品也出現(xiàn)同樣的問(wèn)題與現(xiàn)象。許多檢測(cè)、監(jiān)測(cè)樣品的包裝、保存與運(yùn)輸上不符合國(guó)家《高致病性病原微生物菌（毒）種或者樣本運(yùn)輸包裝規(guī)范》規(guī)定。樣品的標(biāo)記與采樣表填寫(xiě)不清楚、信息不全等。這些不規(guī)范、低品質(zhì)樣品無(wú)法準(zhǔn)確有效地用于PCR 實(shí)驗(yàn)，不能真實(shí)反映出病原情況，無(wú)法溯源和為實(shí)際的疫情防控工作提供科學(xué)的預(yù)警依據(jù)。

2.2 PCR 檢測(cè)儀器設(shè)備的使用

PCR 病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)中重要的幾種儀器設(shè)備主要是冷凍離心機(jī)、低溫冰箱、生物安全柜、全自動(dòng)核酸提取儀、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。這些儀器的操作與維護(hù)關(guān)系到PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、有效性。如普通的低溫冰箱，通常-20℃儲(chǔ)存PCR 試劑（酶、引物、dNTP 混合物等），若沒(méi)有正常的維護(hù)與溫度檢查記錄，冰箱因不明原因不能維持-20℃工作，實(shí)驗(yàn)室人員不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致保存在這個(gè)冰箱中的PCR 試劑（尤其是酶與引物）不穩(wěn)定，檢測(cè)時(shí)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果（實(shí)際工作中出現(xiàn)一次情況，導(dǎo)致檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可用）。生物安全柜的正確使用關(guān)系到整個(gè)PCR 實(shí)驗(yàn)室污染源的防控，其消毒、清潔環(huán)節(jié)是對(duì)PCR 實(shí)驗(yàn)的核酸提取、體系配置等操作外環(huán)境的控制。全自動(dòng)核酸提取儀是獲取樣本核酸的關(guān)鍵步驟，熟悉儀器的性能、規(guī)范操作使用該儀器是PCR 實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵步驟。使用全自動(dòng)核酸提取儀時(shí)不可忽略核酸提取試劑盒的查驗(yàn)，該試劑盒為試劑公司批量生產(chǎn)，其加入的試劑不免也會(huì)出現(xiàn)漏加現(xiàn)象，在實(shí)際工作中就遇到有些試劑盒中漏加磁珠的問(wèn)題，此外手動(dòng)加入樣品時(shí)其編號(hào)不可打亂，以免樣品與最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能一一對(duì)應(yīng)，更不能少加或漏加提取核酸用的酶。PCR 實(shí)驗(yàn)中PCR 儀的使用與維護(hù)對(duì)PCR 檢測(cè)的結(jié)果具有直接影響，PCR程序的設(shè)置因不同病原體檢測(cè)其程序各不相同，切勿在使用過(guò)程中因慌忙而點(diǎn)錯(cuò)程序，程序運(yùn)行前一定檢查核對(duì)正確后再點(diǎn)擊開(kāi)始。電泳儀的使用要注意電泳液的配置與電源線(xiàn)正負(fù)極的插入，長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)使用電泳槽中的電泳液會(huì)影響樣品電泳的效果，應(yīng)適時(shí)更換新配置的電泳液，放置電泳的膠塊時(shí)切忌方向不能放反，否則PCR 產(chǎn)物跑出膠塊后無(wú)法獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。凝膠成像系統(tǒng)是得出PCR 試驗(yàn)結(jié)果使用的最后儀器，對(duì)于該儀器的使用需要做好培訓(xùn)與指導(dǎo)，實(shí)際操作中步驟雖然簡(jiǎn)單，但不可粗心大意。

2.3 PCR 檢測(cè)技術(shù)人員

一是檢測(cè)技術(shù)人員缺乏的問(wèn)題。在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室人員配備數(shù)量與實(shí)際需求不符[3]，這是基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中的普遍現(xiàn)象；文山州中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室僅有3 名PCR 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員，這與實(shí)際實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、監(jiān)測(cè)工作需求不符；基層獸醫(yī)從事實(shí)驗(yàn)室工作多為兼職人員，中心3 名實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員除承擔(dān)高致病性禽流感、新城疫、非洲豬瘟、豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳、口蹄疫、小反芻獸疫等病原學(xué)檢測(cè)與監(jiān)測(cè)工作外，還負(fù)責(zé)抗體監(jiān)測(cè)、春秋防疫工作、獸藥飼料檢測(cè)及其他行政工作等。二是人員的基礎(chǔ)知識(shí)、檢測(cè)技術(shù)問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員缺乏分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)知識(shí)，疏于對(duì)PCR 技術(shù)知識(shí)的學(xué)習(xí)與更新，對(duì)檢測(cè)原理知其然而不知其所以然，無(wú)法正確判斷或發(fā)現(xiàn)實(shí)際檢測(cè)工作中的許多細(xì)節(jié)問(wèn)題。如為何一人所做的PCR 實(shí)驗(yàn)其陰、陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)不同的結(jié)果（假陽(yáng)性、假陰性）；為何同一樣品重復(fù)多次檢測(cè)，其結(jié)果各不相同；為何有些樣品PCR條帶出現(xiàn)拖尾，有些樣品條帶明亮整齊但卻不是目的條帶；PCR 電泳中為何有些產(chǎn)物只是肉眼可見(jiàn)一條染色帶，有些產(chǎn)物則肉眼可見(jiàn)兩條染色帶等問(wèn)題?；鶎荧F醫(yī)實(shí)驗(yàn)人員大多知道做PCR 實(shí)驗(yàn)的整個(gè)流程，而缺乏分析和解決實(shí)驗(yàn)中實(shí)際問(wèn)題的能力，中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)人員無(wú)有效途徑進(jìn)行PCR 檢測(cè)技術(shù)知識(shí)的交流學(xué)習(xí)與更新。目前中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室人員在從事病原學(xué)檢測(cè)工作前多從事屠宰檢疫或其他方面的工作，且年齡普遍偏大（年齡在50 歲左右），對(duì)精細(xì)的分子生物學(xué)PCR 檢測(cè)工作存在一些操作上粗心大意的問(wèn)題，不熟悉移液槍的使用導(dǎo)致取液不準(zhǔn)確；動(dòng)作該輕柔的地方反而劇烈震蕩；配制不同PCR 檢測(cè)體系容易混淆等。

2.4 PCR 實(shí)驗(yàn)室生物安全問(wèn)題

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的生物安全是開(kāi)展動(dòng)物疫病病原正常檢測(cè)與監(jiān)測(cè)工作的重要保障，是實(shí)驗(yàn)室人員身體健康與安全的基本保障。獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室工作人員在進(jìn)行PCR 病原學(xué)監(jiān)測(cè)與檢測(cè)工作時(shí)接觸的病原樣本復(fù)雜多樣，其中不乏一些人畜共患病（高致病性禽流感、布魯氏菌病、狂犬病等）樣品。如2019 年12 月，某研究所人員因做實(shí)驗(yàn)感染了布魯氏菌?。ê?jiǎn)稱(chēng)布?。?，用血的教訓(xùn)證明生物安全實(shí)驗(yàn)室是一把“雙刃劍”，它既是動(dòng)物疫病防控的實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)也是最易造成病原傳播和感染人員的危險(xiǎn)場(chǎng)所[4]，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室人員長(zhǎng)期工作在生產(chǎn)一線(xiàn)，存在極大的生物安全隱患[5]，因此，PCR 實(shí)驗(yàn)室的生物安全管理與防護(hù)十分重要。中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在辦公樓三樓，除獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室外還有3 間相鄰的辦公室，獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的分子生物安全問(wèn)題不僅限于實(shí)驗(yàn)室區(qū)域也關(guān)系到外圍辦公區(qū)和單位周邊的廣大居民的安全問(wèn)題。

3 采取的對(duì)策與措施

3.1 規(guī)范樣品的采集、包裝、運(yùn)輸

針對(duì)采集樣品不規(guī)范的問(wèn)題，文山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心邀請(qǐng)專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員對(duì)基層獸醫(yī)進(jìn)行多次動(dòng)物疫病檢測(cè)、監(jiān)測(cè)采樣技術(shù)培訓(xùn)。通過(guò)與基層獸醫(yī)面對(duì)面溝通交流，從樣品采集、采集工具的運(yùn)用、采集信息的填寫(xiě)、不同動(dòng)物疫病樣品的采集方法等方面答疑解惑，從而使基層獸醫(yī)人員對(duì)采集合格的動(dòng)物疫病病原學(xué)檢測(cè)、監(jiān)測(cè)樣品有了充分的認(rèn)識(shí)，并在實(shí)際采樣工作中執(zhí)行到位，有效提高文山州動(dòng)物疫病病原學(xué)PCR 檢測(cè)、監(jiān)測(cè)樣品的品質(zhì)。這在多次培訓(xùn)后收到的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)樣品情況中得以體現(xiàn)，樣品品質(zhì)基本符合對(duì)應(yīng)檢測(cè)、監(jiān)測(cè)病原的條件與要求，大大方便了檢測(cè)工作的開(kāi)展及動(dòng)物疫病病原的追溯。針對(duì)樣品包裝與運(yùn)輸，中心實(shí)驗(yàn)室采取集中培訓(xùn)指導(dǎo)，強(qiáng)制性按不同動(dòng)物疫病病原樣本運(yùn)輸包裝規(guī)范執(zhí)行送樣，若不符合規(guī)定的則拒絕接收和檢測(cè)樣品，出現(xiàn)問(wèn)題的則采取嚴(yán)厲處罰措施，并通報(bào)批評(píng)。

3.2 規(guī)范PCR 檢測(cè)儀器設(shè)備的使用與維護(hù)

檢測(cè)儀器設(shè)備的使用與維護(hù)是確保PCR 實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行的基礎(chǔ)設(shè)施保障，是技術(shù)保障中的基石。針對(duì)儀器設(shè)備的有效使用與維護(hù)，中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室制定了分子生物學(xué)儀器設(shè)備檔案管理、儀器設(shè)備使用與維護(hù)程序文件，儀器設(shè)備管理員實(shí)名制管理與維護(hù)。并采取專(zhuān)人培訓(xùn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員對(duì)不同儀器設(shè)備的正確、有效使用，最大化地提高儀器設(shè)備的有效利用率。建立儀器設(shè)備使用記錄實(shí)時(shí)登記制度，不僅有利于檢測(cè)技術(shù)人員時(shí)刻規(guī)范自我檢測(cè)操作過(guò)程，且便于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量監(jiān)督人員的技術(shù)監(jiān)督管理。同時(shí)為PCR 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程留下痕跡可查可驗(yàn)，有助于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員查找實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)節(jié)問(wèn)題。

3.3 加強(qiáng)PCR 檢測(cè)技術(shù)人員的管理與培訓(xùn)指導(dǎo)

基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員需要通過(guò)不斷學(xué)習(xí)與交流豐富分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，訓(xùn)練及規(guī)范PCR 實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，提高實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)與分析解決實(shí)驗(yàn)問(wèn)題的能力。中心為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員提高綜合技術(shù)能力采取“送出去，請(qǐng)進(jìn)來(lái)”的培養(yǎng)方式，即送技術(shù)人員出去學(xué)習(xí)的同時(shí)也請(qǐng)專(zhuān)家到本地培訓(xùn)指導(dǎo)。與此同時(shí)，增加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員在分子生物學(xué)知識(shí)及技術(shù)方面的交流學(xué)習(xí)機(jī)會(huì)，擴(kuò)寬實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員對(duì)PCR 技術(shù)及新發(fā)展的其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)的學(xué)習(xí)途徑。且通過(guò)加強(qiáng)引導(dǎo)檢測(cè)技術(shù)人員的學(xué)習(xí)，優(yōu)化試劑、儀器、樣本、環(huán)境等的管理，強(qiáng)化檢測(cè)方法、檢測(cè)過(guò)程的管控，積極參與國(guó)家、省級(jí)組織的檢測(cè)能力比對(duì)實(shí)驗(yàn)等外部質(zhì)量控制[6，7]，有效地提高中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的PCR 檢測(cè)技術(shù)能力。

3.4 加強(qiáng)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全管理

中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)制定相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室生物安全操作技術(shù)規(guī)范、廢棄物處理操作程序、實(shí)驗(yàn)室生物安全程序文件及實(shí)驗(yàn)室生物安全標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程等，全面涵蓋國(guó)家《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》中的各項(xiàng)生物安全管理[8]。且對(duì)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展管理評(píng)審和內(nèi)部審核工作，對(duì)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室涉及的病原微生物及從事的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)各方面進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估為基礎(chǔ)，從根本上確保實(shí)驗(yàn)室生物安全[9]。加大實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)機(jī)制的建設(shè)與措施的落實(shí)，提高基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員生物安全防護(hù)意識(shí)，確保實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)生物安全技術(shù)達(dá)標(biāo)，保證獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作安全的有序開(kāi)展。