平頦海蛇的化學(xué)成分研究

姚海萍，梁振綱，楊先會(huì)，鄧世明

1海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 海南大學(xué)海洋學(xué)院，海口 570228

平頦海蛇(Lapemis curtus)為眼鏡蛇科平頦海蛇屬的爬行動(dòng)物，俗名棘海蛇，國(guó)內(nèi)主要分布于海南、福建、臺(tái)灣、山東、香港、廣西［1］，已被廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)收載，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)作用［2］。海南民間常用于泡酒、煲湯治療各類風(fēng)濕疾病，效果顯著。關(guān)于平頦海蛇的化學(xué)成分，我國(guó)學(xué)者雷羽等以青環(huán)海蛇和平頦海蛇的混合干體為研究對(duì)象，從中提取分離得到膽甾醇、1-甲基海因等4 個(gè)化合物。為了研究海蛇藥用功效的物質(zhì)基礎(chǔ)及擴(kuò)大藥源，本實(shí)驗(yàn)對(duì)平頦海蛇干體的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，共分離得到7 個(gè)化合物，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。并利用DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)測(cè)定了所得到的單體化合物的抗氧化活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1H NMR 和13C NMR 由Bruker AM-400 型(TMS為內(nèi)標(biāo))核磁共振譜儀測(cè)定。熔點(diǎn)由數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定(X-4，北京泰克儀器有限公司，溫度未校正)。Sephadex LH-20 是Pharmacia 公司產(chǎn)品。柱層析硅膠(200～300 目)和薄層色譜硅膠板是青島海洋化工廠產(chǎn)品，所有試劑均為分析純。

1.2 樣品

平頦海蛇干體4.7 kg，購(gòu)于?？谑袞|門市場(chǎng)，經(jīng)海南大學(xué)鄧世明教授參考中國(guó)動(dòng)物志和廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)鑒定，憑證標(biāo)本存放于海南大學(xué)海洋學(xué)院。

1.3 提取與分離

取平頦海蛇干體(全體)4.7 kg 粉粹，用75%乙醇(15 L)回流提取4 次，經(jīng)薄層層析檢測(cè)基本提取完全。提取液減壓濃縮(低于55 ℃)回收乙醇得浸膏，將浸膏用適量水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分別減壓回收溶劑后，得石油醚部分浸膏約136.5 g 和乙酸乙酯部分浸膏約78.0 g，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)石油醚部分浸膏進(jìn)行分離純化。

取石油醚部分浸膏(130 g)，經(jīng)硅膠干柱層析，石油醚:氯仿:乙酸乙酯(2∶2∶1)洗脫，分為5 個(gè)組分:A-E。取A 段，經(jīng)反復(fù)硅膠層析和重結(jié)晶得化合物1;B 段經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析和Sepadex LH-20(氯仿:甲醇1∶1)，得化合物2～3;E 段經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析和Sepadex LH-20(氯仿:甲醇1∶1)，得化合物4～7。

1.4 DPPH 自由基清除試驗(yàn)

用無(wú)水乙醇將DPPH 配制成1 ×10-4mol/L 的溶液，置于冰箱中冷藏備用。實(shí)驗(yàn)共分3 組，每組總體積為3 mL，第1 組在試管中加入1.0 mL DPPH 溶液(1 ×10-4mol/L)和2 mL 無(wú)水乙醇，混勻后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，記為A0;第2 組加入1.0 mL DPPH 溶液(1 ×10-4mol/L)和2.0 mL 試樣，搖勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min 后測(cè)吸光度值，記為Ai;第3 組加入1.0 mL 無(wú)水乙醇和2.0 mL 試樣混勻，測(cè)定吸光度值記為Aj。每個(gè)化合物樣品均設(shè)置6 個(gè)質(zhì)量濃度:2.0，1.5，1.0，0.8，0.6，0.4 mg/mL，每一吸光度值平行測(cè)3 次，取其平均值，按公式:清除率%計(jì)算自由基清除率;并求出清除率為50% 時(shí)樣品的質(zhì)量濃度(SC50)，樣品的活性結(jié)果即以半數(shù)清除質(zhì)量濃度(SC50)表示。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末，mp.130～132 ℃，硫酸-乙醇顯紫色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:0.65 (3H，s，H-18)，0.83 (6H，d，J=6.6Hz，H-26，27)，0.88 (3H，d，J=6.5Hz，H-21)，0.98 (3H，s，H-19)，3.49(1H，m，H-3)，5.35 (1H，brs，H-6);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:37.3(C-1)，31.7 (C-2)，71.8 (C-3)，42.4 (C-4)，140.8(C-5)，121.7 (C-6)，31.9 (C-7)，31.9 (C-8)，50.2(C-9)，36.5 (C-10)，21.1 (C-11)，39.8 (C-12)，42.4 (C-13)，56.8 (C-14)，24.3 (C-15)，28.2 (C-16)，56.2 (C-17)，11.8 (C-18)，19.4 (C-19)，35.8(C-20)，18.7 (C-21)，36.2 (C-22)，23.8 (C-23)，39.5 (C-24)，28.0 (C-25)，22.6 (C-26)，22.8 (C-27)。結(jié)合NMR 數(shù)據(jù)及分子量可確定其分子式為:C27H46O;其理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)［3，6］報(bào)道的基本一致，故鑒定該化合物為膽甾醇(cholesterol)。

化合物2 白色膏狀物，硫酸-乙醇顯梅紅色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13MHz)δ:5.35～5.32 (2H，m)，4.81～4.73 (1H，m)，3.07 (1H，d，J=1.8Hz)，2.25 (2H，t，J=7.56Hz)，2.13～1.59 (9H，m)，1.59～1.29 (48H，m)，1.03 (3H，s)，0.85～0.90 (15H，m)，0.64 (3H，s);13C NMR(CDCl3，100.6 MHz)δ:173.46，129.99，129.73，71.05，63.57，62.53，56.21，56.21，51.00，42.30，39.81，39.50，38.07，36.70，36.15，35.73，35.05，34.60，32.50，31.92，29.76，29.69，29.59，29.52，29.45，29.36，29.31，29.14，29.09，28.14，28.00，27.26，27.22，27.16，25.01，24.19，23.82，22.79，22.68，22.55，21.94，18.68，17.03，14.10，11.76，11.76。結(jié)合NMR 數(shù)據(jù)及分子量可確定其分子式為:C47H82O3;其理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)［4，5］報(bào)道的基本一致，故鑒定該化合物為5，6β-Epoxysitosteryl oleate。

化合物3 白色膏狀物，硫酸-乙醇顯紫色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:5.34(2H，m，H-9'，10')，5.26 (1H，m，H-2)，4.13 (2H，dd，J=11.9，5.9 Hz，H-3)，4.29 (2H，dd，J=11.9，4.3 Hz，H-1)，2.30 (6H，td，J=7.6，2.3 Hz，H-2'，2''，2''')，2.00 (4H，m，H-8'，11')，1.60 (6H，m，H-3'，3''，3''')，1.25～1.29 (76H，m，H-4'～7'，H-12'～17'，H-4''～17''，H-4'''～17''')，0.88 (9H，t，J=7.0Hz，H-18'，18''，18''');13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:173.26 (C-1'，1''')，173.22 (C-1'')，68.86(C-2)，62.08 (C-1，3)，34.21 (C-2'')，34.05 (C-2'，2''')，31.92 (C-8'，11')，29.76～22.68 (nCH2)，14.10 (3CH3)。結(jié)合NMR 數(shù)據(jù)及分子量可確定其分子式為:C57H108O6;其理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)［3，6-8］報(bào)道的基本一致，故鑒定該化合物為9-Octadecenoic acid (9Z)-，(2R)-2，3-bis［(1-oxooctadecyl)oxy］propyl ester。

化合物4 白色片狀晶體，mp.157～159 ℃，硫酸-乙醇顯橙黃色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:2.91 (3H，s，-CH3)，3.96 (2H，s，-CH2);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:159.4 (C-2)，173.8 (C-4)，53.9 (C-5)，29.3 (C-6)。結(jié)合NMR 數(shù)據(jù)及分子量可確定其分子式為:C4H6N2O2;其理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)［9］報(bào)道的基本一致，故鑒定該化合物為1-甲基海因(1-methylhydantoin)。

化合物5 白色膏狀物，硫酸-乙醇顯紫色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:4.22(1H，dd，J=11.6，4.6 Hz，H-1'a)，4.19 (1H，dd，J=11.6，6.1 Hz，H-1'b)，3.94(1H，m，H-2')，3.70(1H，dd，J=11.1，4.0 Hz，H-3'a)，3.60 (1H，dd，J=11.5，5.8 Hz，H-3'b)，2.35 (2H，t，J=7.4 Hz，H-2)，1.63 (2H，m，H-3)，1.25 (24H，m，H-4～H-15)，0.87 (3H，t，J=6.6 Hz，H-16);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:70.3 (C-2')，65.2 (C-1')，63.3 (C-3')，34.2 (C-2)，31.9 (C-14)，29.7～29.1 (C-4～C-13)，24.9 (C-3)，22.7 (C-15)，14.1 (C-16)。結(jié)合NMR 數(shù)據(jù)及分子量可確定其分子式為:C19H38O4;以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3，13］報(bào)道的基本一致，故鑒定該化合物為α-棕櫚酸甘油酯(α-palmityl glycerin ester)。

化合物6 白色粉末，mp.59～62 ℃，硫酸-乙醇顯梅紅色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:0.88 (3H，t，J=7.0 Hz)，1.25 (28H，m，H-2～H-15)，1.57 (2H，m)，1.96 (brs，-OH)，3.44～3.56 (4H，m)，3.65 (1H，dd，J=11.39，5.09 Hz)，3.72 (1H，dd，J=11.39，3.87 Hz)，3.85 (1H，brs);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:72.54，71.87，70.39，64.34，31.93，29.69～29.35，26.09，22.69，14.11。結(jié)合NMR 數(shù)據(jù)及分子量可確定其分子式為:C19H40O3;其理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)［5，12，14-16］報(bào)道的基本一致，故鑒定該化合物為鮫肝醇(Chimyl alcohol)。

化合物7 白色粉末，硫酸-乙醇顯藍(lán)色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:5.73(1H，brd，J=4.83 Hz，H-6)，3.62 (1H，m，H-3)，0.66 (3H，s，CH3-18)，0.98 (3H，s，CH3-19)，0.92(3H，d，J=6.49 Hz，CH3-21)，0.87 (3H，d，J=1.66 Hz，CH3-26)，0.86 (3H，d，J=1.66 Hz，CH3-27)，0.91 (3H，t，J=6.49 Hz，CH3-29)，3.54 (3H，s，OMe)，3.28 (1H，brt，H-7);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:36.7 (C-1)，39.5 (C-2)，71.5 (C-3)，42.3(C-4)，146.1 (C-5)，120.8 (C-6)，73.9 (C-7)，37.3 (C-8)，42.7(d，C-9)，37.5 (C-10)，20.8 (C-11)，39.1 (C-12)，42.1 (C-13)，49.1 (C-14)，24.3(C-15)，28.2 (C-16)，55.9 (C-17)，11.5 (C-18)，18.3 (C-19)，35.8 (C-20)，18.8 (C-21)，31.5 (C-22)，36.2 (C-23)，35.7 (C-24)，28.0 (C-25)，22.5(C-26)，22.8 (C-27)，23.8 (C-28)，11.9 (C-29)，56.8 (OMe)。結(jié)合NMR 數(shù)據(jù)及分子量可確定其分子式為:C30H52O2;其理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)［11，12］報(bào)道的基本一致，故鑒定該化合物為7α-甲氧基-β-谷甾醇(7α-methoxyl-β-sitosterol)。

3 化合物的抗氧化活性

利用DPPH (1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除實(shí)驗(yàn)［17］，對(duì)從平頦海蛇中分離得到的單體化合物進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試，其中化合物1 有極微弱抗氧化活性，SC50值為0.777 mg/mL，陽(yáng)性對(duì)照BHT(2，6-二叔丁基對(duì)甲苯酚)的SC50值為0.0217 mg/mL，其他化合物無(wú)抗氧化活性，故結(jié)果表明各化合物幾乎無(wú)抗氧化活性。

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