基于生物信息學(xué)的青藤堿治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制研究△

尚昱志，韋露秋，陳秋霞，唐秀松，方剛，張青槐，黃安，龐宇舟

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病[1]。RA的全球患病率約為0.5%～1%[2]，在中國(guó)患病率約為0.42%[3]。其病理過(guò)程所致的關(guān)節(jié)損害、畸形無(wú)法逆轉(zhuǎn)，相關(guān)研究顯示RA患者病程在5～10年的致殘率為60%，病程達(dá)30年的患者致殘率高達(dá)90%[4-5]。RA的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，亦缺少可根治RA的藥物，醫(yī)學(xué)界仍在探索高效安全的RA治療藥物[6-7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是生物信息學(xué)衍生出的新興學(xué)科，強(qiáng)調(diào)了將生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)與藥物作用網(wǎng)絡(luò)整合[8]。反向分子對(duì)接技術(shù)是通過(guò)計(jì)算機(jī)將化學(xué)分子與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)對(duì)接來(lái)尋找潛在蛋白質(zhì)靶標(biāo)的技術(shù)[9]，以改善藥物發(fā)現(xiàn)和藥物設(shè)計(jì)過(guò)程，從而解決未滿(mǎn)足的醫(yī)療需求[10]。近年來(lái)，反向分子對(duì)接技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等生物信息學(xué)技術(shù)已較廣泛用于中藥單體、單藥及復(fù)方的作用機(jī)制研究[11]。

青風(fēng)藤具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)的功效，周仲瑛、李濟(jì)仁、劉祖貽等國(guó)醫(yī)大師均擅用其治療RA[12-14]。青藤堿(sinomenine，SN)是從青風(fēng)藤中提取生物堿，相關(guān)研究表明其具有免疫抑制、抗炎等作用，現(xiàn)已用于RA的臨床治療[15-16]，但從系統(tǒng)生物學(xué)整體層面對(duì)SN治療RA作用機(jī)制研究仍較缺乏。因此，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)SN治療RA的作用機(jī)制進(jìn)行探索分析。

1 材料與方法

1.1 SN可藥性評(píng)估

TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)是融合了藥物化學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)等信息的中藥研究分析平臺(tái)，并提供了藥物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)等相關(guān)屬性供可藥性評(píng)估[17]。在TCMSP平臺(tái)中檢索“sinomenine”，獲取SN的mol2格式文件及ADME相關(guān)屬性。

1.2 反向分子對(duì)接預(yù)測(cè)SN潛在靶點(diǎn)

DRAR-CPI (http：//cpi.bio-x.cn/drar/)是可用于反向分子對(duì)接的服務(wù)器，通過(guò)藥物與蛋白質(zhì)的相互作用預(yù)測(cè)化合物的潛在靶標(biāo)，對(duì)接分?jǐn)?shù)Z′-score越小，表示化合物和靶點(diǎn)的結(jié)合越牢固，當(dāng)Z′-score<-0.5時(shí)化合物與靶點(diǎn)有潛在結(jié)合的可能[18-19]。將SN的mol2格式文件上傳至DRAR-CPI服務(wù)器進(jìn)行反向分子對(duì)接，將對(duì)接獲得的Z′-score<-0.5的靶蛋白確定為納入本研究的SN潛在靶點(diǎn)。

1.3 RA疾病靶點(diǎn)獲取

DisGeNET(http：//www.disgenet.org/)是整合了包括CTD、UniProt、HPO等數(shù)據(jù)庫(kù)資源的人類(lèi)疾病相關(guān)基因和變異信息數(shù)據(jù)的綜合平臺(tái)[20]，應(yīng)用DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)獲取RA疾病基因靶標(biāo)。

1.4 靶點(diǎn)名稱(chēng)規(guī)范

利用UniProt[21](https：//www.uniprot.org/)中ID映射功能，物種設(shè)置為“人”，將Gene Symbol、PDB ID等多種基因、蛋白名稱(chēng)以UniProt ID為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行映射，對(duì)映射結(jié)果進(jìn)行人工確認(rèn)、整理。

1.5 SN治療RA潛在靶點(diǎn)獲取

運(yùn)用Diagram平臺(tái)(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將SN潛在靶點(diǎn)與RA疾病靶點(diǎn)作交集，取共同作用靶標(biāo)即SN治療RA潛在靶點(diǎn)。

1.6 SN治療RA潛在靶點(diǎn)的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub靶點(diǎn)篩選

在GeneMANIA(http：//www.genemania.org/)[22]中限定物種為“人”，將SN治療RA的47個(gè)潛在靶點(diǎn)輸入進(jìn)行相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并篩選出hub靶點(diǎn)。

1.7 GO和KEGG通路富集分析

GO主要用于分析基因產(chǎn)物的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能[23]。以Ensembl(http：//www.ensembl.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)[24]中的GRC38.P5為GO背景基因文件，將SN治療RA的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Omicshare平臺(tái)(http：//www.omicshare.com/)中的動(dòng)態(tài)GO富集分析工具進(jìn)行分析及柱狀圖繪制。

KEGG(https：//www.genome.jp/kegg/)是整合了基因組、疾病信息等的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，其KEGG通路圖對(duì)已完成測(cè)序的基因組進(jìn)行生物學(xué)解釋?zhuān)粡V泛用于分析基因組學(xué)、代謝組學(xué)等數(shù)據(jù)[25]。將SN治療RA的潛在靶點(diǎn)信息導(dǎo)入KOBAS 3.0(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)[26]獲取顯著富集的KEGG通路，并將相關(guān)結(jié)果導(dǎo)入Omicshare平臺(tái)中繪制通路散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果

2.1 SN的ADME相關(guān)屬性

SN的相對(duì)分子質(zhì)量(MW)為329.43，正辛醇與水之間的分配系數(shù)(AlgP)為1.32，極性表面積(TPSA)為5.9 nm2，結(jié)構(gòu)中的氫鍵給體(Hdon)和氫鍵受體(Hacc)數(shù)分別為1和5，口服生物利用度(OB)為30.98%，Caco-2通透性(Caco-2)為0.62，血腦屏障通透性(BBB)為0.43 nm·s-1，類(lèi)藥性(DL)為0.46，允許圍繞自身自由旋轉(zhuǎn)的鍵數(shù)(RBN)為2，藥物半衰期(HL)為1.79 h。

2.2 SN治療RA的潛在靶點(diǎn)

通過(guò)DRAR-CPI服務(wù)器進(jìn)行反向分子對(duì)接預(yù)測(cè)出SN的靶點(diǎn)蛋白345個(gè)，其中Z′-score<-0.5的靶蛋白131個(gè)納入本研究。在DisGeNET檢索獲得的RA疾病相關(guān)靶點(diǎn)1818個(gè)。將SN與RA的靶蛋白作交集(見(jiàn)圖1)，得到SN治療RA的潛靶點(diǎn)47個(gè)(見(jiàn)表1)。

表1 SN治療RA的潛在靶點(diǎn)信息

圖1 SN與RA靶點(diǎn)交集

2.3 SN治療RA潛在靶點(diǎn)的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

除去1個(gè)暫未發(fā)現(xiàn)與其它基因相互聯(lián)系的靶點(diǎn)，其余46個(gè)SN治療RA的潛在靶點(diǎn)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的自由度越高，即該節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)其他節(jié)點(diǎn)數(shù)量越多[27]，圖2網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的平均自由度約為16，節(jié)點(diǎn)的大小與其自由度成正比，自由度大于平均自由度2倍以上的節(jié)點(diǎn)認(rèn)為是該網(wǎng)絡(luò)的hub節(jié)點(diǎn)[28]，即腫瘤蛋白53(TP53)、蛋白激酶B1(AKT1)、硫氧還蛋白(TXN)為SN治療RA潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的hub靶點(diǎn)。

圖2 SN治療RA的潛在靶點(diǎn)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.4 富集分析

2.4.1GO富集分析 GO富集結(jié)果中包括了16個(gè)生物學(xué)過(guò)程、7個(gè)分子功能和10個(gè)細(xì)胞組分(見(jiàn)圖3)。

圖3 SN治療RA的潛在靶點(diǎn)GO富集

2.4.2KEGG通路富集分析 按P值選取SN治療RA的潛在靶點(diǎn)富集最顯著的前10條通路(見(jiàn)圖4)，圖中縱軸為通路名稱(chēng)，橫軸富集因子為潛在靶點(diǎn)中屬于該通路的基因的數(shù)量與該通路所包含基因的數(shù)量的比值。

圖4 SN治療RA潛在靶點(diǎn)的顯著富集的前10條通路

3 討論

不良的ADME是藥物研發(fā)晚期失敗的重要原因之一，通過(guò)計(jì)算機(jī)方法可以提高預(yù)測(cè)和模擬ADME能力，從而簡(jiǎn)化和加速藥物研發(fā)過(guò)程[29]。里賓斯基提出的五規(guī)則是是藥物篩選的經(jīng)典規(guī)則，SN的MW、Hdon、Hacc和AlgP均符合里賓斯基的藥物篩選要求[30-31]，且其較高的Caco-2參透性代表具有較高小腸上皮細(xì)胞通透性[32]，BBB>0.3 nm·s-1表示對(duì)血腦屏障具有強(qiáng)穿透力[33]，TPSA<6 nm2表示滲透細(xì)胞膜[34]，DL≥0.18亦符合中藥化合物類(lèi)藥性的篩選標(biāo)準(zhǔn)[35]，以上SN的理化性質(zhì)共同反映出其具有良好的可藥性。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)SN治療RA的機(jī)制研究主要集中在促炎因子、抗炎因子、基質(zhì)金屬蛋白酶方面，主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Toll樣受體(TLR)、酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT、RANK/RANKL/OPG)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、活化T細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NFATc1)等信號(hào)通路等，研究發(fā)現(xiàn)SN可能是通過(guò)抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17等促炎因子的表達(dá)，上調(diào)IL-10、IL-4等抗炎因子，降低基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、MMP2、MMP3等的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)、減少骨破壞、促進(jìn)組織損傷修復(fù)等起到治療RA的作用[36-38]。

本研究通過(guò)反向分子對(duì)接技術(shù)與疾病靶點(diǎn)相映射，預(yù)測(cè)出SN治療RA的潛在靶點(diǎn)47個(gè)，其中IL-10在 RA患者血清中存在異常高表達(dá)[39-40]，相關(guān)研究證明SN可提高CIA大鼠血清中抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平[41]，破骨細(xì)胞形成是RA骨破壞的重要因素，NF-κB配體的受體激動(dòng)劑對(duì)于破骨細(xì)胞形成有重要意義，相關(guān)研究表明SN可降低NF-κB配體介導(dǎo)MAPK14的磷酸化[42]，故IL-10、MAPK14根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究可推測(cè)作為SN治療靶點(diǎn)，其余45個(gè)潛在靶點(diǎn)尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。GeneMANIA分析結(jié)果(見(jiàn)圖2)提供了靶點(diǎn)間的相互作用信息，在通過(guò)GeneMANIA構(gòu)建的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)獲得的3個(gè)hub靶點(diǎn)中，TP53被認(rèn)為與RA的成纖維樣滑膜細(xì)胞增生和關(guān)節(jié)破壞相關(guān)[43]；AKT1被認(rèn)為與RA滑膜成纖維細(xì)胞生成有關(guān)[44]；TXN被認(rèn)為是RA、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等風(fēng)濕類(lèi)疾病的差異表達(dá)基因[45]，故SN對(duì)AKT1、TP53、TXN表達(dá)的影響可作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究重點(diǎn)。

GO富集結(jié)果按生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組件和分子功能以柱狀圖的形式的對(duì)基因功能分類(lèi)情況予直觀展現(xiàn)(見(jiàn)圖3)。在相關(guān)潛在靶點(diǎn)顯著富集的前10條通路中(見(jiàn)圖4)，細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路和Rap1信號(hào)通路已有相關(guān)研究表明與RA相關(guān)[46-49]，但尚未發(fā)現(xiàn)SN直接調(diào)控該4條通路的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。將這4條通路中包含的SN潛在作用靶點(diǎn)作交集(見(jiàn)圖5)，得到的交集基因的AKT1與預(yù)測(cè)出hub靶點(diǎn)一致，說(shuō)明SN很可能作用于AKT1等靶點(diǎn)進(jìn)而影響這4條通路對(duì)RA疾病過(guò)程發(fā)揮作用。

圖5 SN治療RA的潛在關(guān)鍵通路中靶點(diǎn)交集

本研究通過(guò)TCMSP評(píng)估SN的可藥性，利用反向分子對(duì)接技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)出了SN治療RA的潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建了靶點(diǎn)間相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示SN具有良好的可藥性，可能通過(guò)作用于AKT1、TP53、TXN、IL-10、MAPK14等靶點(diǎn)及細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路等通路影響RA的疾病過(guò)程，為后期相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及臨床應(yīng)用研究提供了數(shù)據(jù)支撐。