雷公藤甲素致L5178Y細(xì)胞及小鼠Pig-a基因突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)△

王亞楠，閆明，2，汪祺*，文海若*

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009

雷公藤甲素(triptolide，TPL)來(lái)源于雷公藤的根，是其主要活性成分之一，研究表明雷公藤具有抗炎、抗風(fēng)濕、抗癌等廣泛的生物活性[1-4]。隨著雷公藤甲素應(yīng)用的增多，大量研究報(bào)道表明，雷公藤甲素具有生殖功能毒性、腎毒性、肝毒性等[5-7]，另外，其對(duì)人體潛在的遺傳毒性也成為研究關(guān)注的重點(diǎn)。本課題組采用歐盟開(kāi)發(fā)的基于決策樹(shù)的毒性預(yù)測(cè)平臺(tái)Toxtree軟件(Version 3.1.01851，Istituto Superiore di Sanita，Italy)預(yù)測(cè)顯示其存在遺傳毒性致癌性、鼠傷寒沙門(mén)氏菌結(jié)構(gòu)預(yù)警及嚙齒類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)微核結(jié)構(gòu)預(yù)警。然而，其遺傳毒性產(chǎn)生的具體影響尚缺乏相關(guān)研究，僅有部分研究提出，TPL可能導(dǎo)致染色體損傷，如曹易懿[8]研究指出TPL(0.5～75 nmol·L-1)可以誘導(dǎo)人成淋巴TK6細(xì)胞微核率升高，楊建一等[9]發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷10～30 mg·kg-1能夠引起小鼠骨髓細(xì)胞微核率和染色體畸變率升高。基因突變是癌癥發(fā)生與發(fā)展的重要原因，也是遺傳毒性評(píng)價(jià)的重要檢測(cè)終點(diǎn)之一，當(dāng)前TPL致基因突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方面的研究較少。

Pig-a基因位于X染色體，編碼形成糖磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定生物合成所需的N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的催化亞基，其片段中單一突變即可影響GPI錨的合成，并導(dǎo)致細(xì)胞表面GPI錨鏈蛋白的缺失(如CD59、CD24、CD90等)，從而可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜表面錨鏈蛋白表達(dá)水平評(píng)價(jià)受試物的潛在致基因突變風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)基于Pig-a基因的體外研究也獲得一定進(jìn)展，有相關(guān)研究使用小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞建立體外Pig-a基因突變模型并已對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證研究[10-12]。本實(shí)驗(yàn)室首次在國(guó)內(nèi)成功建立并驗(yàn)證基于L5178Y細(xì)胞的體外Pig-a基因突變模型[13]。本研究使用L5178Y細(xì)胞和昆明種(KM)小鼠分別開(kāi)展體外和體內(nèi)Pig-a基因突變研究，評(píng)價(jià)TPL的潛在致基因突變風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

L5178Y TK+/-(3.7.2C)細(xì)胞來(lái)自日本國(guó)立醫(yī)藥品食品衛(wèi)生研究所，經(jīng)支原體檢查后于液氮長(zhǎng)期保存。研究所用細(xì)胞為復(fù)蘇傳代后10代以內(nèi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性KM小鼠25只，5～6周齡，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0005)；在恒溫(20～26 ℃)、恒濕(40%～70%)、各12 h明暗周期的條件下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)密度為每籠2～3只；提供經(jīng)鈷60放射滅菌的鼠全價(jià)顆粒飼料，自由攝食及飲水，取材前不禁食禁水。

1.3 試藥

TPL(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111567-201404，純度：99.8%)；二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：#BCBW5664)、6-磷酸葡萄糖(批號(hào)：WXBC7942V)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉(批號(hào)：18E2156560)、青鏈霉素混合液(批號(hào)：2019313)、N-乙基-N-亞硝基脲 (N-nitroso-N-ethylure，ENU，批號(hào)：MKCD2123，純度：98%)、甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS，批號(hào)：126K0758，純度：98%)、苯并芘[benzoapyrene，B(a)P，批號(hào)：SLBF45532，純度：96%)均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；馬血清(批號(hào)：AC10235369)、磷酸鹽緩沖液(PBS，批號(hào)：AD19942268)，Hyclone公司；APC標(biāo)記CD45抗體(批號(hào)：7166674)、PE標(biāo)記CD90.2抗體(批號(hào)：7110569)、PE標(biāo)記CD24抗體(批號(hào)：553262)、PE標(biāo)記CD61抗體(批號(hào)：553347)均購(gòu)自BD Biosciences公司；抗-PE磁珠(批號(hào)：51810917330)、LS柱(批號(hào)：5180614049)均購(gòu)自Miltenyi公司；哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞分離液(批號(hào)：55-182，Cedarlane公司)、SYTO?13 綠色熒光核酸染料(批號(hào)：1987320)、RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：2025394)、胎牛血清(FBS，批號(hào)：1908121)、絕對(duì)計(jì)數(shù)磁珠(批號(hào)：C3695)均購(gòu)自Thermo Fisher公司；肝勻漿S9(批號(hào)：20181105，北京安保迪科技有限公司)。

1.4 儀器

FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD bioscience公司)；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；HERA cell VIOS 160i型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；NU-543-400S型生物安全柜(Nuair公司)；CKX31型倒置顯微鏡(Nikon公司)；QuadroMACSTMSeparator免疫磁性分離架(Miltenyi公司)。

2 方法

2.1 基于L5178Y細(xì)胞的體外Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)

2.1.1細(xì)胞培養(yǎng) 將L5178Y細(xì)胞解凍復(fù)蘇后置于完全培養(yǎng)基R10(含10%馬血清、1%青-鏈霉素混合液、丙酮酸鈉0.2 mg·mL-1的RPMI 1640培養(yǎng)基)，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基隔天更換，待細(xì)胞增殖至適宜密度后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.2TPL對(duì)L5178Y細(xì)胞的毒性檢測(cè) 非S9(-S9)代謝條件：細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，更換R0培養(yǎng)基(含1%青-鏈霉素混合液和丙酮酸鈉0.2 mg·mL-1的RPMI 1640培養(yǎng)基)，分為對(duì)照組(DMSO)、陽(yáng)性對(duì)照組(EMS 500 μg·mL-1)和TPL不同質(zhì)量濃度(6.3、12.5、25、50、100 ng·mL-1)組，各組加入不同藥物后，調(diào)整細(xì)胞密度為50×104個(gè)/mL于10 mL培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下與受試物作用24 h。收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，室溫離心(340×g，5 min)，PBS洗滌2次。將細(xì)胞重懸于10 mL完全培養(yǎng)基R10并維持密度為1.0×106～2.0×106個(gè)/mL，培養(yǎng)8 d。

S9(+S9)代謝條件：細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，更換R0培養(yǎng)基，分為對(duì)照組(DMSO)、陽(yáng)性對(duì)照組[B(a)P 5.0 μg·mL-1]和TPL不同質(zhì)量濃度(12.5、25、50、100、200 ng·mL-1)組，各組加入不同藥物和2% S9后，調(diào)整細(xì)胞密度為50×104個(gè)/mL于50 mL離心管中，置于氣浴搖床中37 ℃、20 r·min-1振搖4 h。細(xì)胞經(jīng)室溫離心(340×g，5 min)后，PBS洗滌2次。將細(xì)胞重懸于10 mL完全培養(yǎng)基R10。給藥后24 h細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度維持為1.0×106～2.0×106個(gè)/mL，培養(yǎng)8 d。

細(xì)胞毒性通過(guò)細(xì)胞倍增速率(PD)和相對(duì)細(xì)胞倍增速率(RPD)進(jìn)行評(píng)價(jià)，見(jiàn)公式(1)～(2)。

PD=lg(受試物處理后細(xì)胞數(shù)/初始細(xì)胞數(shù))/lg2

(1)

RPD=(PD藥物/PD對(duì)照)×100%

(2)

2.1.3TPL對(duì)L5178Y細(xì)胞Pig-a基因突變率的影響 細(xì)胞分組及處理同2.1.2項(xiàng)下。取2×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行離心(340×g，4 ℃，5 min)，棄上清，每組加5 mL工作液(含有2%FBS的PBS)，混勻離心(340×g，4 ℃，5 min)。吸棄上清液，每孔加入CD45、CD90.2抗體混合工作液200 μL，終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1，重懸細(xì)胞并混合均勻。將細(xì)胞置于2～8 ℃避光孵育30 min，后置于室溫繼續(xù)孵育10 min。孵育結(jié)束后，重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至5 mL工作液中離心(340×g，4 ℃，3 min)。吸棄上清液，加入300 μL工作液，混合均勻后轉(zhuǎn)入流式管中上機(jī)檢測(cè)。突變型細(xì)胞表面無(wú)CD90.2蛋白，CD45蛋白正常表達(dá)，故在流式圖中顯示無(wú)藻紅蛋白(PE)熒光，別藻藍(lán)蛋白(APC)熒光正常，根據(jù)公式(3)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)突變數(shù)。

細(xì)胞相對(duì)突變數(shù)=突變細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×106

(3)

2.2 KM小鼠體內(nèi)Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)

2.2.1分組與給藥 KM小鼠在給藥前檢疫適應(yīng)6 d。根據(jù)文獻(xiàn)及課題組前期研究確定最終實(shí)驗(yàn)用TPL劑量為50、100、200 μg·kg-1[14-15]。檢疫期第6天按體質(zhì)量隨機(jī)分組法分為5組(對(duì)照組、雷公藤甲素各劑量組、陽(yáng)性對(duì)照ENU組)，每組5只，分組時(shí)個(gè)體體質(zhì)量差異小于平均體質(zhì)量的±20%。ENU給藥方式為腹腔注射，僅于首次給藥日給藥1次，其余給藥方式為經(jīng)口灌胃，連續(xù)給藥28 d，給藥體積為10 mL·kg-1。

2.2.2小鼠體質(zhì)量檢測(cè) 研究期間每天觀察小鼠癥狀，給藥及給藥結(jié)束后每周各測(cè)定2次體質(zhì)量，直至解剖結(jié)束試驗(yàn)。

2.2.3TPL對(duì)小鼠Pig-a基因突變率的影響 第0、14、28、42、56天使用毛細(xì)管經(jīng)眼內(nèi)眥采血收集80～100 μL新鮮血液于K2EDTA采血管，混勻防止凝血。轉(zhuǎn)移60 μL血液置于含有100 μL 1%肝素鈉的EP管中稀釋抗凝，全部轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞分離液，離心，洗滌紅細(xì)胞(RBC)。將RBC與抗體進(jìn)行2～8 ℃、避光孵育20 min，取1管溶媒對(duì)照組細(xì)胞懸液不經(jīng)抗體標(biāo)記，2～8 ℃保存，作為模板調(diào)試組分A，孵育結(jié)束后離心(340×g，4 ℃，5 min)，洗脫轉(zhuǎn)移。所有細(xì)胞組均加入Anti-PE磁珠懸液置于2～8 ℃、避光孵育20 min，孵育完成后離心(340×g，4 ℃，5 min)，洗脫。柱前樣品和模板調(diào)試組分A核酸染色：向流式管中加入990 μL核酸染料-計(jì)數(shù)微球混合工作液，取10 μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，室溫避光孵育10 min，后置于4 ℃避光孵育5 min，此為柱前樣品。取同一溶媒對(duì)照組樣品作為模板調(diào)試組分B。搭建免疫磁性分離架，洗滌工作液潤(rùn)洗，后加入上述剩余細(xì)胞懸液，上柱分離，待全部組分流出后加入洗滌工作液洗滌分選柱，用同一離心管收集洗出液，離心(800×g，4 ℃，5 min)，棄上清，向離心管中加入300 μL核酸染料-計(jì)數(shù)微球混合工作液全部轉(zhuǎn)移至流式管中，室溫避光孵育15 min。孵育完成后于2～8 ℃、避光保存至少5 min，在3 h內(nèi)上流式分析，此為柱后樣品。取相等體積(各200 μL)模板調(diào)試組分A、B充分混合，吹打均勻，即得含50%突變細(xì)胞和50%野生細(xì)胞的模板調(diào)試樣品，高速上樣，調(diào)節(jié)電壓和熒光補(bǔ)償，建立分析模板。建立模板后，進(jìn)行柱前/后樣品檢測(cè)，高速上樣，每份柱前樣品分析1000個(gè)計(jì)數(shù)微球時(shí)停止，每份柱后樣品盡可能分析全部細(xì)胞懸液。隨后根據(jù)柱前和柱后樣本分析突變細(xì)胞數(shù)目。

因RBC無(wú)細(xì)胞核，通過(guò)核酸染料可對(duì)RBC和網(wǎng)織紅細(xì)胞(RTC)進(jìn)行區(qū)分，突變型細(xì)胞表面無(wú)CD24蛋白，通過(guò)PE熒光對(duì)突變型細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)(RET)。按照公式(3)～(4)分別計(jì)算RBC、RTC的相對(duì)突變數(shù)及RTC占比。

RTC占比=RET/RBC×100%

(4)

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 L5178Y細(xì)胞Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)

3.1.1TPL的細(xì)胞毒性 TP給藥后24 h(-S9)及4 h(+S9)的RPD結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，-S9代謝和+S9代謝狀態(tài)下TPL各質(zhì)量濃度組RPD均大于50%[12]，提示TP在給藥質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用。

圖1 TPL對(duì)L5178Y細(xì)胞RPD的影響

3.1.2TPL對(duì)L5178Y細(xì)胞Pig-a基因突變的影響 -S9和+S9代謝狀態(tài)下TPL給藥組24 h后培養(yǎng)8 d 時(shí)Pig-a基因突變頻率結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TPL各劑量組細(xì)胞相對(duì)突變數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且無(wú)劑量依賴性(見(jiàn)圖2～3)。

注：A.-S9代謝條件；B.+S9代謝條件。圖2 -S9和+S9代謝條件下TPL對(duì)L5178Y細(xì)胞Pig-a基因突變的影響

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001。圖3 TPL對(duì)L5178Y細(xì)胞Pig-a基因突變的影響

3.2 小鼠Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)

3.2.1TPL對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 KM小鼠連續(xù)灌胃給予TPL 28 d后繼續(xù)觀察28 d，期間未見(jiàn)死亡。但TPL給藥組多只小鼠出現(xiàn)相互撕咬，發(fā)現(xiàn)后立即分籠飼養(yǎng)，另有尾尖壞死、毛發(fā)稀疏、精神不佳等表現(xiàn)，其中TPL 100、200 μg·kg-1組分別有3、2只，發(fā)生率為30%。實(shí)驗(yàn)期間所有組小鼠平均體質(zhì)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，給藥組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖4)，提示連續(xù)28 d給予KM小鼠200 μg·kg-1及以下劑量TPL未產(chǎn)生明顯整體毒性。

圖4 TPL對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

3.2.2TPL對(duì)小鼠Pig-a基因突變率的影響 給藥第28天對(duì)照組、TPL各劑量組和ENU組柱前和柱后樣品流式結(jié)果顯示(見(jiàn)圖5～6)，所有組小鼠RTC占比隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，在給藥28 d結(jié)束后略有升高，該現(xiàn)象可能與RBC生成減少后的代償性RTC增加有關(guān)。與對(duì)照組比較，TPL各劑量組小鼠RTC占比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性對(duì)照ENU組小鼠RBC和RTC的細(xì)胞相對(duì)突變數(shù)自給藥14 d后與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示實(shí)驗(yàn)體系成立。而TPL各劑量組小鼠在首次給藥后56 d內(nèi)RBC和RTC的細(xì)胞相對(duì)突變數(shù)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在實(shí)驗(yàn)條件下，TPL 200 μg·kg-1及以下劑量對(duì)KM小鼠無(wú)堿基突變風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 TPL對(duì)小鼠Pig-a基因突變率的影響

注：A.RTC占比；B.RBC細(xì)胞相對(duì)突變數(shù)；C.RTC細(xì)胞相對(duì)突變數(shù)；與對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001。圖6 TPL對(duì)KM小鼠Pig-a基因突變的影響

4 討論

TPL是一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，內(nèi)酯是一種活性化學(xué)物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)合成、溶劑、脫漆劑和抗菌藥物的中間體。含有TPL的藥物制劑如雷公藤多苷片、雷公藤片等在臨床上應(yīng)用極為廣泛，故對(duì)TPL的遺傳毒性進(jìn)行研究尤為重要。內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)作為預(yù)警結(jié)構(gòu)在Toxtree的決策樹(shù)下顯示在-S9代謝條件下存在致突變風(fēng)險(xiǎn)[14，16-17]。TPL自身毒性較大，給藥劑量選擇是研究的難點(diǎn)之一。本課題組前期研究結(jié)果[15]顯示連續(xù)3 d給予SD大鼠TPL 450 μg·kg-1未見(jiàn)動(dòng)物死亡。李新秀等[18]研究顯示，連續(xù)給予TPL 14 d后200 μg·kg-1組見(jiàn)1只KM小鼠死亡(1/6)，其解剖結(jié)果顯示臟器等無(wú)異常；連續(xù)給予TPL 28 d后，200 μg·kg-1組KM小鼠死亡率達(dá)33%(3/9)，分析其原因是動(dòng)物數(shù)目較少可存在較大個(gè)體差異或因人為因素造成。綜合以上結(jié)果，本研究確定TPL最大給藥劑量為200 μg·kg-1。研究結(jié)果顯示，連續(xù)28 d給予KM小鼠TPL 200 μg·kg-1及以下劑量，未見(jiàn)小鼠死亡，但動(dòng)物整體狀態(tài)不佳，提示200 μg·kg-1作為最大給藥劑量研究其潛在遺傳毒性致突變較合理。

本課題組在國(guó)內(nèi)首次使用L5178Y細(xì)胞建立和驗(yàn)證體外Pig-a基因突變模型，L5178Y細(xì)胞自發(fā)背景突變率低，無(wú)需進(jìn)行前期預(yù)清除，保證實(shí)驗(yàn)靈敏度與準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，在本研究條件下，TPL給藥組L5178Y細(xì)胞基因突變頻率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示無(wú)遺傳毒性致突變作用。在體內(nèi)Pig-a基因突變研究中，課題組前期連續(xù)3 d重復(fù)給予SD大鼠TPL 450 μg·kg-1，在首次給藥前和末次給藥后7、14、28、35、56 d所有時(shí)間點(diǎn)尾靜脈采血進(jìn)行流式檢測(cè)，與對(duì)照組比較均未見(jiàn)Pig-a基因突變率上升[15]。本研究采用KM小鼠連續(xù)給藥28 d，并于給藥前和首次給藥后14、28、42、56 d眼內(nèi)眥采血進(jìn)行流式檢測(cè)，TPL各劑量組均未見(jiàn)Pig-a基因突變率上升，再次驗(yàn)證TPL無(wú)體內(nèi)致Pig-a基因突變作用。TPL自身結(jié)構(gòu)較大，在DNA復(fù)制過(guò)程無(wú)法模擬堿基插入DNA序列引起堿基對(duì)的改變，造成基因突變，這也與相關(guān)研究報(bào)道TPL存在遺傳毒性主要是導(dǎo)致染色體損傷等相一致[19-20]。本研究結(jié)果表明，TPL不具有遺傳毒性致Pig-a基因突變作用，驗(yàn)證軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，為后續(xù)研究提供參考。