高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中喹乙醇的不確定度評(píng)估

楊彥寧，歐海軍，譚美英，隆雪明，周燦，陳福華

（湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，長(zhǎng)沙410000）

隨著“造肉1號(hào)“味霸”“速肥肽”等非法飼料添加劑的曝光，“喹乙醇”逐步進(jìn)入公眾視野。這種被稱為“新型瘦肉精”的藥物，是1965年由德國(guó)人合成的一種抗菌助生長(zhǎng)劑[1]，具有蛋白同化作用，可提高飼料轉(zhuǎn)化率與瘦肉率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。但大劑量的使用喹乙醇會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性作用[2]。喹乙醇在體內(nèi)具有一定蓄積性，可對(duì)動(dòng)物或人產(chǎn)生致畸、致癌、致突變[3]。歐洲和美國(guó)已經(jīng)禁止喹乙醇作為飼料添加劑使用。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2638號(hào)公告也明確表示，由于喹乙醇獸藥的原料藥及各種制劑可能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全存在風(fēng)險(xiǎn)隱患，根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》第六十九條規(guī)定，決定停止在食品動(dòng)物中使用喹乙醇。因此，喹乙醇檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性在保障動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，確保養(yǎng)殖環(huán)節(jié)依法、科學(xué)、合理用藥，為獸藥執(zhí)法監(jiān)管工作的有效開展提供有力的支撐時(shí)顯得尤為重要。

本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定飼料中喹乙醇，采用JJF-1059-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》、JJF1135-2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定評(píng)定》、CNAS-GL006-2019《化學(xué)分析中不確定度評(píng)估指南》等對(duì)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)估，對(duì)不確定度各分量進(jìn)行計(jì)算，探究影響檢測(cè)結(jié)果不確定度的影響因素，為評(píng)定檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供參考[4-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（AB 3200Q Trap）：配有電噴霧離子源（ESI），固相萃取裝置，喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品（Dr），HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL），甲醇、乙腈、甲酸（色譜純）。

1.2 檢測(cè)方法

依據(jù)農(nóng)業(yè)部2086號(hào)公告-5-2014《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 樣品制備

準(zhǔn)確稱量預(yù)混合飼料1 g（精確至0.01 g），加入0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL，渦旋1 min，40℃超聲波清洗儀中超聲10 min，9 000 r·min-1離心15 min，收集上清液。殘?jiān)?.1%甲酸-乙腈溶液10 mL重復(fù)提取1次，合并提取液，混勻，準(zhǔn)確量取5.0 mL總提取液于10 mL試管中，60℃氮?dú)獯抵良s2 mL，加入0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液，充分溶解殘余物，為備用液。轉(zhuǎn)移至已活化的HLB固相萃取柱，待試樣完全通過固相萃取柱后用0.02 mol·L-1鹽酸3 mL和5%甲醇3 mL淋洗，擠干，用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液并氮?dú)獯蹈?，?0%乙腈溶液1 mL充分溶解，過0.22μm濾膜后上高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）檢測(cè)。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm 1.7μm），柱溫為40℃；進(jìn)樣體積10μL流速為0.5 mL·min-1，流動(dòng)相A乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液，梯度為0～0.5 min，體積分?jǐn)?shù)為5%的B溶液；0.5～4 min，體積分?jǐn)?shù)為5%～90%的B溶液，4～6 min，體積分?jǐn)?shù)為90%的B溶液，6～7 min，體積分?jǐn)?shù)為90%～5%的B溶液。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子化模式為電噴霧正離子模式，質(zhì)譜掃描方式為MRM，離子源溫度為600℃、碰撞能量及定性定量離子質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1喹乙醇質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)學(xué)模型

采用外標(biāo)法定量，按下式計(jì)算喹乙醇含量：

式中，X為樣品中待測(cè)組分含量（mg·kg-1）；C被測(cè)樣品濃度（μg·mL-1）；V1提取液定容體積；V2用于SPE凈化的提取液體積，5 mL；V3最終上機(jī)的濃縮液體積，1 mL；m樣品質(zhì)量（g）。上述公式依據(jù)樣品測(cè)定原理給出，未考慮隨機(jī)因素對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。

2.2 不確定度來源

根據(jù)檢測(cè)過程和喹乙醇含量的計(jì)算公式，得到不確定度來源圖，見圖1。

2.3 各分量標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)估

2.3.1測(cè)量重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由于分析過程中，很多操作引入的不確定度具有一定的重復(fù)性，如天平稱量，移液管轉(zhuǎn)移液體，容量瓶定容體積，回收率等操作等，因此，可以將此類分量進(jìn)行歸納，引入重復(fù)性，即精密度，用于分析研究過程中隨機(jī)變化引入的不確定度。精密度主要采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方式進(jìn)行研究，對(duì)加標(biāo)樣品中喹乙醇含量進(jìn)行一系列平行測(cè)試，得到分析過程總隨機(jī)變化，以該標(biāo)準(zhǔn)化差值的標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)估試驗(yàn)過程的重復(fù)性不確定度。

在重復(fù)性條件下，對(duì)同一加標(biāo)樣品中喹乙醇的含量進(jìn)行獨(dú)立8次測(cè)量，結(jié)果見表2，綜合上述數(shù)據(jù)，按照貝塞爾公式計(jì)算測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差，單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其算數(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

重復(fù)條件下，喹乙醇含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

上述分量合并研究各種隨機(jī)因素，如體積讀數(shù)偏差、LC-MS/MS變動(dòng)，樣品混合不均勻以及HLB固相萃取小柱對(duì)回收率的影響等，后續(xù)評(píng)定其他分量時(shí)，不再考慮各種隨機(jī)因素。

2.3.2試樣稱量引入的不確定度

試樣稱量引入的不確定度主要是天平的校準(zhǔn)，允許誤差±0.001 g，假定為均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

預(yù)混合飼料1 g，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3提取液V1引入的不確定度

用10 mL單標(biāo)吸管吸取10 mL 0.1%甲酸-乙腈提取液，根據(jù)檢定規(guī)程JJG196-2006[8]，10 mL A級(jí)吸管允許誤差為±0.02 mL，假定為三角分布，則10 mL的單標(biāo)吸管的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由于方法中，需重復(fù)提取1次，兩次移取獨(dú)立不相關(guān)，因此，提取液引入的不確定度合成得：

圖1喹乙醇檢測(cè)過程中不確定度來源

表2加標(biāo)飼料中喹乙醇含量mg kg-1

2.3.4凈化液V2引入的不確定度

從提取液中量取5.0 mL待氮吹、凈化，根據(jù)檢定規(guī)程JJG196-2006，5 mL A級(jí)單標(biāo)吸管允許誤差為±0.015 mL，假定為三角分布，則5 mL單標(biāo)吸管的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.5用于測(cè)定樣品定容體積V3引入的不確定度

用1 mL的單標(biāo)吸管量取20%乙腈溶液充分溶解已吹干試樣，根據(jù)檢定規(guī)程JJG196-2006，1 mL A級(jí)單標(biāo)吸管的允許誤差為±0.007 mL，假定為三角分布，1 mL的單標(biāo)吸管的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.6標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度：方法中采用的喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度為97.89%，根據(jù)證書提供的不確定度為0.73%，假定均勻分布，則其不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度：準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)品喹乙醇8.523 85 g，稱量時(shí)使用分辨率0.000 01 g分析天平，由2.3.2可知，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容引入的不確定度：標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容至10 mL，使用容量瓶為10 mL A級(jí)，根據(jù)檢定規(guī)程JJG196-2006，10 mL A級(jí)容量瓶的允許誤差為±0.02 mL，假定為三角分布，則10 mL的容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，在標(biāo)準(zhǔn)液配制時(shí)引入的不確定度由上述三種合成，即

使用標(biāo)準(zhǔn)溶液因溫度變動(dòng)引起的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度不確定度：室溫（20±5℃），甲醇的膨脹系數(shù)為1.1×10-3/℃，則由溫度引起的體積變化為±5×1.1×10-3=±0.005 05 mL，假定均勻分布，則：u（T）=標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度由以上不確定度合成，由標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度為：

2.3.7測(cè)定液引入的不確定度

本次人工配制濃度為0.834 4 mg·mL-1喹乙醇儲(chǔ)備液，稀釋為62.58、104.3、208.6、417.2、834.4 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)系列，引入不確定度，校正曲線為Ai=a+bCi，由工作曲線變動(dòng)性引起濃度c的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為：校正曲線各個(gè)參數(shù)如表3所示。

表3校正曲線參數(shù)

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4.1相對(duì)不確定度

各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表4。

表4相對(duì)不確定度各分量

按照評(píng)定不確定度的測(cè)量模型計(jì)算喹乙醇含量的合成不確定度，

本次測(cè)定，樣品中喹乙醇為0.763 mg·kg-1，則

2.4.2擴(kuò)展不確定度

根據(jù)國(guó)際慣例95%置信概率取包含因子K=2，則擴(kuò)展不確定度為u（x）=k×u=2×0.012 2=0.024 4 mg·kg-1。

2.5 檢測(cè)結(jié)果的表示

用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定飼料中喹乙醇，結(jié)果表示為（0.763±0.0244）mg·kg-1，其中擴(kuò)展系數(shù)為k=2。

3 結(jié)果分析

由相對(duì)不確定度直方圖（見圖2）可以看出，對(duì)喹乙醇結(jié)果影響最大的是urel（V1），即提取液的體積，其次是重復(fù)性操作urel（fr）及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制urel（s），因此，在對(duì)飼料中喹乙醇含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，應(yīng)盡量確保提取液體積移取準(zhǔn)確，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及稀釋精準(zhǔn)，在條件允許情況下，多作平行樣，保證重復(fù)性操作的規(guī)范性，消除系統(tǒng)誤差影響。

圖2相對(duì)不確定度直方圖

4 結(jié)論

通過分析高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定飼料中喹乙醇不確定度來源，對(duì)各不確定度分量進(jìn)行計(jì)算，得出當(dāng)飼料中喹乙醇含量為0.763 mg·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.0244 mg·kg-1（k=2）。通過對(duì)其中不確定分量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素是提取液體積、重復(fù)性操作、以及標(biāo)準(zhǔn)品的配制與稀釋，因此，在實(shí)際檢測(cè)中，應(yīng)嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，保證移液管等規(guī)范使用，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確無誤，也應(yīng)加強(qiáng)檢驗(yàn)人員崗位培訓(xùn)，確保試驗(yàn)過程規(guī)范性和重現(xiàn)性，減小此類不確定度分量對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來的影響，也為飼料質(zhì)量安全控制提供有效、可靠、可溯源的測(cè)量數(shù)據(jù)。