抗氧化劑在豬精液冷凍保存中的作用

康樂毅 ，趙俊金 ，鄧曉彬 ，程 晨 ，劉 剛 ，張永紅 ，郭 勇 ，邢 凱 ＊,倪和民 ＊

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.全國畜牧總站，北京 100193；3.北京田園奧瑞生物科技有限公司，北京 100096；4.中國農(nóng)業(yè)出版社有限公司（數(shù)字出版與管理中心），北京 100125）

豬繁殖技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)由自然繁殖過渡到鮮精繁殖再到凍精繁殖。與常規(guī)液態(tài)保存精液相比較，豬的冷凍精液繁殖技術(shù)成績并不理想。文內(nèi)就近幾年應(yīng)用在豬冷凍精液的新型抗氧化劑進(jìn)行綜述，完善豬冷凍精液技術(shù)的相關(guān)研究理論。希望最終加大推廣凍精使用的力度，提高生產(chǎn)效益。

1 豬精子冷凍過程中的氧化損傷

哺乳動(dòng)物精子細(xì)胞具有高度特異的脂質(zhì)組成，高含量的多不飽和脂肪酸、血漿蛋白原和鞘磷脂。這種不同尋常的精子膜結(jié)構(gòu)決定了它的靈活性和精子細(xì)胞的功能能力。然而，精子的脂質(zhì)是過氧化的主要底物，可能會(huì)引起嚴(yán)重的精子功能障礙。另一方面，低（生理）水平的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)反映了活性氧（ROS）對(duì)精子代謝的影響，增強(qiáng)了精子與透明帶相互作用的能力[1]。精子膜的病理性脂質(zhì)過氧化程度較高的一個(gè)原因可能是氧化應(yīng)激失衡。

多不飽和脂肪酸（PUFAs）在精子細(xì)胞膜中的過氧化反應(yīng)是一種自催化、自繁殖的反應(yīng)，可引起細(xì)胞功能障礙。過氧化反應(yīng)的第一步，稱為起始反應(yīng)，是從不飽和脂肪酸中提取一個(gè)氫原子。第二步增殖是脂質(zhì)烷基自由基的形成，然后與氧快速反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化自由基。由于過氧自由基和烷基自由基被再生，繁殖循環(huán)可以無限期地持續(xù)下去，直到自由基反應(yīng)中某個(gè)底物被消耗或終止[2]。

此外，精子膜脂參與配子的相互作用。其中一種是半乳糖基甘油脂質(zhì)[3]，另一種是溶血磷脂酰膽堿[4]，可刺激精子受精能力，引起透明帶成分的改變，并促進(jìn)卵膜的精卵融合?？傊?，位于精子膜中的全脂成分參與調(diào)節(jié)精子成熟、精子發(fā)生、獲能、頂體反應(yīng)并最終參與膜融合。顯然，精子脂質(zhì)過氧化也會(huì)干擾上述精子的所有功能，極端情況下甚至?xí)耆种凭拥男纬伞?/p>

過量的自由基產(chǎn)生經(jīng)常涉及精子發(fā)生的錯(cuò)誤，導(dǎo)致精子從生發(fā)上皮釋放，表現(xiàn)出異常高水平的細(xì)胞質(zhì)保留。多余的細(xì)胞質(zhì)中含有酶，為精子的質(zhì)膜氧化還原系統(tǒng)進(jìn)一步生成ROS提供燃料。這種氧化應(yīng)激的后果包括精子喪失運(yùn)動(dòng)性和受精潛力，以及誘導(dǎo)精子細(xì)胞核的DNA損傷。精子功能的喪失是由于精子原生膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用，導(dǎo)致精子喪失流動(dòng)性，細(xì)胞喪失功能[5]。

2 抗氧化劑在豬精液冷凍保存中的作用

抗氧化劑的使用可以將氧化損傷的破壞降低，并顯著提高解凍后精子的各項(xiàng)指標(biāo)。最近幾年，許多研究人員在稀釋液內(nèi)添加不同的抗氧化劑[6]，證明了抗氧化劑在精液冷凍保存上起到了重要作用。

2.1 芝麻酚

芝麻酚是芝麻油中的重要的香氣成分，是芝麻油的品質(zhì)穩(wěn)定劑。易溶于極性有機(jī)溶劑，是一種常見的抗氧化劑。

芝麻酚作為承擔(dān)抗氧化作用的內(nèi)活性物質(zhì)、保護(hù)不飽和脂肪酸不被氧化[7]，故芝麻油要比其他植物油更為穩(wěn)定。在食品領(lǐng)域，添加芝麻酚可延長食品的保存時(shí)間[8]，提高油脂的抗氧化能力。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，特別在醫(yī)學(xué)損傷防護(hù)上，芝麻酚也發(fā)揮著保護(hù)作用。在降低DNA損傷[9]、提高DNA自我損傷修復(fù)能力[10-11]效果明顯。

王捷[12]等人通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)添加適量的芝麻酚可以顯著提高精子解凍后指標(biāo)以及精子內(nèi)抗氧化酶活性，添加0.2 g/L的芝麻酚時(shí)精液保存效果最好。

2.2 葡萄籽原花青素

葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提取出的新型抗氧化劑，同時(shí)也是目前為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效自由基清除劑[13]。李春陽等人[14]研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素的抗氧化、清除自由基的能力隨著純化程度的提高也相應(yīng)地提高。

孫艷青[15]等人發(fā)現(xiàn)添加葡萄籽原花青素對(duì)豬精子起到了很好的抗氧化保護(hù)能力，最適添加濃度為40 μg/mL，可以顯著降低丙二醛水平，解凍后精液各項(xiàng)指標(biāo)均得到提升。

2.3 維生素P

維生素P是一種植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，又名蘆丁、橘皮素等[16]。維生素P具有增強(qiáng)其他維生素功效、防止瘀傷、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)傳染性疾病的抵抗及抗氧化[17]等作用。

維生素P具有心臟保護(hù)[18]、抗菌消炎、抗癌、調(diào)節(jié)毛細(xì)血管通透性的作用，臨床上用于治療高血壓、心腦血管疾病等，起到了不錯(cuò)的治療效果。前人研究表明，維生素P具有清除自由基的功能[19]。夏維木[20]證明維生素P可以清除超氧根離子，并且清除的效率很高。同時(shí)維生素P由于結(jié)構(gòu)的特殊性，能夠螯合金屬離子，起到抵抗脂質(zhì)過氧化的功能，從而保護(hù)精子，減少損傷。維生素P作為酮類化合物，其結(jié)構(gòu)與活性之間存在密切的關(guān)系。基團(tuán)的數(shù)量和結(jié)構(gòu)都會(huì)影響活性[21]。

吳琳[22]研究發(fā)現(xiàn)在冷凍保存的過程中，添加0.6 mM的維生素P，可以顯著提高精子的結(jié)構(gòu)完整性，提高抗氧化酶的酶活性，降低有害代謝產(chǎn)物含量。相比較而言，當(dāng)添加1.0 mM和2.0 mM的維生素P后并沒有明顯提高精子的生理特征，很可能是由于添加高濃度的維生素P使得細(xì)胞的滲透壓增大，改變了精子的生存環(huán)境。

2.4 α-硫辛酸

α-硫辛酸（Alpha-lipoic acid，ALA）是一種來源于辛酸的有機(jī)硫化物，它是一種天然的抗氧化劑，廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，作為許多酶的必須因子來參與機(jī)體生化反應(yīng)。

由于α-硫辛酸是一種天然強(qiáng)抗氧化劑，因此在國際上對(duì)于α-硫辛酸的研究從來都未停止過。α-硫辛酸能夠有效降低經(jīng)高葡萄糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[22]。Park[23]等研究發(fā)現(xiàn)α-硫辛酸可以上調(diào)抗凋亡和抗氧化基因的表達(dá)，以此可以改善內(nèi)皮功能紊亂。在α-硫辛酸對(duì)精子冷凍保存影響方面，Ma等人[24]研究發(fā)現(xiàn)α-硫辛酸能夠提高山羊精子活力及在精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因過程中保護(hù)精子不被氧化損傷。

胡曉辰[25]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)冷凍基礎(chǔ)液中單獨(dú)添加一定濃度的α-硫辛酸和維生素C均能有效提高凍后豬精子總抗氧化能力和抗氧化酶活力；其最佳濃度分別為6.0 mg/L和400 mg/L；聯(lián)合添加二者的冷凍保存效果優(yōu)于單獨(dú)添加，其最佳配伍濃度為4.0 mg/Lα-硫辛酸和600 mg/L維生素C。

2.5 中草藥提取物

2.5.1 靈芝多糖

靈芝在我國具有400多年的悠久應(yīng)用歷史[28]，靈芝屬真菌。靈芝多糖是從靈芝中提取出來具有生物活性的一種物質(zhì)，其具有調(diào)節(jié)免疫[29]、抗氧化[30]、抗癌[31]、防衰老、改善睡眠、降低血糖等生理活性[32]。

吳琳[22]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)在冷凍精液保存的過程中，添加0.8 mg/mL的靈芝多糖，可以顯著提高精子結(jié)構(gòu)完整性及抗氧化酶活性，但對(duì)線粒體活性沒有顯著的增強(qiáng)作用。

由于靈芝多糖是一種大分子的物質(zhì)，不能夠進(jìn)入到精子的細(xì)胞內(nèi)部，只能夠在精子細(xì)胞的外面進(jìn)行保護(hù)。推測(cè)其保護(hù)機(jī)制可能是在細(xì)胞膜的外邊形成一層保護(hù)膜，進(jìn)而使得膜和頂體的完整性提高，但不能夠?qū)€粒體進(jìn)行保護(hù)，同時(shí)研究表明當(dāng)靈芝多糖的濃度過高時(shí)，精子的活率開始降低，很可能是由于多糖自身具有黏性，吸附在精子的周圍，從而阻礙了精子的運(yùn)動(dòng)，使得活率降低。還可能是因?yàn)榫€粒體是精子運(yùn)動(dòng)的能量來源，而靈芝多糖并不能提高線粒體的活性，從而使得精子的運(yùn)動(dòng)能力降低，從而導(dǎo)致活力降低[32]。

2.5.2 丹參酮 IIA

丹參酮IIA（TanshinoneⅡA）是唇形科植物丹參的主要提取成分[33-34]。吳琳[22]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)在常溫保存中，在豬精子常溫稀釋液中添加0.9 mM的丹參酮IIA，可以顯著提高精子質(zhì)膜及頂體完整性。在冷凍保存的過程中，在豬精液冷凍稀釋液中添加1.2 mM的丹參酮IIA，可以顯著提高精子質(zhì)量，顯著降低MDA含量和提高抗氧化酶中SOD酶活性和GSH-Px酶活性，但對(duì)質(zhì)膜的完整性和CAT酶的活性的提升沒有作用。

2.6 其他抗氧化劑

褪黑素是色氨酸的衍生物，主要在松果腺合成和分泌，也存在于哺乳動(dòng)物的卵巢、睪丸、骨髓、視網(wǎng)膜和晶狀體等多種組織中。褪黑素具有多種重要的生理功能，如控制晝夜節(jié)律、誘導(dǎo)睡眠、調(diào)節(jié)季節(jié)性繁殖、增強(qiáng)免疫力和抗氧化作用等。褪黑素最基本的功能被認(rèn)為是它的抗氧化功能，它可以保護(hù)生物體免受氧化損傷。褪黑素也是一種強(qiáng)有力的自由基清除劑，包括可以清除引發(fā)脂質(zhì)過氧化的過氧化物自由基和羥基自由基。

此外維生素C、維生素E、谷胱甘肽及一些內(nèi)源的超氧化物歧化酶與過氧化氫酶也在精液抗氧化上發(fā)揮著作用。由于前人對(duì)這些抗氧化劑研究較為深入，故在此不多做介紹。

3 展望

非洲豬瘟形勢(shì)下，活體引種和鮮精運(yùn)輸受限，使用豬凍精配種的豬場(chǎng)正在逐步增加。據(jù)報(bào)道，豬藍(lán)耳病病毒、豬瘟病毒等病毒能通過精液傳播，精液存在垂直傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)；凍精的長時(shí)間保存特性可以使人們有充足的時(shí)間檢測(cè)各種健康指標(biāo)，杜絕精液垂直傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)；凍精的長距離運(yùn)輸、長效保存，突破了時(shí)空限制，使養(yǎng)豬生產(chǎn)上可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)實(shí)時(shí)選配。隨著未來在新型抗氧化劑探索及抗凍劑稀釋液的優(yōu)化上研究逐步深入，豬冷凍精液的推廣和使用勢(shì)必發(fā)展迅速，其解凍后指標(biāo)也逐漸向鮮精靠攏。