植物源活性肽的研究開發(fā)概況

李依娜，余元善，肖更生,3*，徐玉娟，鄒波，鄒穎

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610；2.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510631）

生物活性肽是由不同氨基酸排列構成的、分子量介于50～10 000 Da、結構介于氨基酸與蛋白質之間的一種分子聚合物[1]。肽的生物活性很強且具有重要的營養(yǎng)生理功能Bhandari 等[2]，將生物活性肽定義為分離的蛋白質小片段，認為它們在機體中充當潛在的改良劑，可降低許多慢性疾病的風險，具有維持生理健康的益處，能用于功能食品、抗炎抗菌藥品和抗衰老化妝品[3]等相關產(chǎn)品的研發(fā)。

植物源活性肽是從植物中分離得到的具有生理功能的肽類化合物，其來源廣泛，種類較多，從植物源食物中獲取抗氧化肽、降壓肽、抗血栓肽等已被廣泛研究報道[4]。如張一帆等[5]通過模擬體內(nèi)消化得到的楊梅活性肽具有良好的抗氧化和α-葡糖糖苷酶抑制活性，且不同分子質量段的活性能力不同；Huang 等[6]對馬鈴薯蛋白水解物進行研究，發(fā)現(xiàn)其純肽氨基酸序列可減輕自發(fā)性高血壓大鼠的心臟肥大和纖維化；Karami 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)通過酶解制備的小麥胚芽活性蛋白肽具有抗氧化、抗癌和血管緊張素轉換酶（ACE）抑制活性；Li 等[8]研究表明玉米麩粉中生物活性肽在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出抗高血壓、保肝、抗肥胖、抗微生物等不同的功能。

2017 年，國家發(fā)展和改革委員會發(fā)文正式把生物活性肽納入優(yōu)先發(fā)展領域，這代表國家正式認可了肽的功能，也準備扶持生物活性肽的發(fā)展。隨著蛋白質工程、酶技術及現(xiàn)代生物技術的快速發(fā)展，越來越多的植物源活性肽被發(fā)掘并得到深入研究，種類和功能不斷豐富。植物蛋白肽獲取成本低，營養(yǎng)價值高，且具有一定的生物學功能[9]，研究植物源活性肽對農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的利用以及新食品的開發(fā)有著重要意義。本文綜述了近5 年國內(nèi)外有關植物源活性肽的開發(fā)及研究文獻，對目前研究的常見種類、制備方法、分離鑒定和功能產(chǎn)品開發(fā)現(xiàn)狀進行了分析，并對其發(fā)展前景進行了展望。

1 植物源活性肽的分類

植物源活性肽按原料可分為大豆肽、大米肽、菠菜肽、玉米肽和亞麻籽肽等；按生物活性可分為抗腫瘤肽、免疫調節(jié)肽、抗氧化肽、抗肥胖肽和抗膽固醇肽等[10]。目前植物源活性肽研究主要集中在豆類和米面類，也有部分研究針對玉米、燕麥、堅果和果蔬。

1.1 大豆活性肽

大豆肽主要來源于大豆球蛋白，以3～6 個氨基酸組成的小分子肽為主，分子質量主要出現(xiàn)在300～700 Da內(nèi)。與大豆蛋白相比，大豆肽具有加熱不凝固、無豆腥味和易溶于水等良好的加工性能。我國于20 世紀80 年代后期開始對大豆肽進行研究，如賈芳[11]通過木瓜蛋白酶制備大豆肽，并按照分子量不同進行分離純化和光譜分析，研究發(fā)現(xiàn)苦味值、抗氧化性、表面疏水力之間存在著一定的正相關性；尹軍杰[12]用不同分子量的大豆肽給小鼠灌胃，測定緩解疲勞指標，結果表明相對分子質量為875 和500 的大豆肽對緩解疲勞指標影響顯著，大豆肽分子量越小，緩解疲勞作用效果越明顯；Taniguchi 等[13]研究發(fā)現(xiàn)商業(yè)大豆蛋白酶解產(chǎn)物中，六種已鑒定的陽離子肽具有抗血管生成活性，在哺乳動物紅細胞中，六種肽即便濃度高達500 μmol/L 時也未出現(xiàn)溶血活性。通過酶解或微生物發(fā)酵獲得的大豆肽具有吸收率高、低抗原性、抗疲勞和促進脂質代謝等特點[14]，目前較多地被應用于大豆肽飲料和功能食品的開發(fā)中。

1.2 大米活性肽

我國大米產(chǎn)量大，其深加工提供了豐富的大米蛋白，利用酶解、發(fā)酵等手段將大米蛋白水解可獲得具有功能活性的肽段。大米肽氨基酸組成合理，具有低致敏性和多種功能活性，可以用來研發(fā)高附加值的產(chǎn)品。目前對大米肽的研究主要集中在抗氧化和ACE 抑制方面，而大米肽對血管內(nèi)皮細胞的保護作用和免疫調節(jié)作用也在逐漸被關注[15-18]。蔡露陽等[19]利用堿性蛋白酶水解大米蛋白，發(fā)現(xiàn)大米肽中分子質量低于1 000 的肽段相比其他分子質量肽段，具有促進嗜酸乳桿菌生長的作用；TONG等[20]從大米α-球蛋白的消化吸收產(chǎn)物中獲取肽AAGALPS，研究其對改善腫瘤壞死因子-α 刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的潛在作用，發(fā)現(xiàn)AAGALPS 可通過介導炎癥和氧化應激來保護血管內(nèi)皮細胞；Aoki-nonaka 等[21]研究發(fā)現(xiàn)來自大米的Amyl-1-18 肽可通過抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生來抑制牙槽骨吸收，對牙周炎有一定的預防和抗炎作用。從近幾年的研究現(xiàn)狀來看，大米肽的制備不斷改善，其潛在的價值和功能活性也在逐漸被發(fā)現(xiàn)和應用。

1.3 燕麥活性肽

燕麥分為皮燕麥和裸燕麥兩種，其蛋白質含量顯著高于大米和小麥，是更為優(yōu)質的谷物蛋白[22]。β-葡聚糖存在于燕麥麩皮中，被認為是燕麥最具開發(fā)潛力的功能成分之一，試驗證明燕麥β-葡聚糖可有效降低腸液中葡萄糖的釋放速率、調節(jié)血脂和降低機體炎癥水平[23]。Du 等[24]從燕麥麩蛋白水解物中分離出八個燕麥肽餾分，發(fā)現(xiàn)它們均有阻止亞油酸氧化的能力，而肽餾分F7 和F5 螯合Fe2+的活性最佳；Comino 等[25]首次發(fā)現(xiàn)新鑒定的燕麥肽對從腹腔病人獲得的循環(huán)樹突狀細胞產(chǎn)生不同的刺激能力，從分子層次表征其具有免疫原性；珠娜等[26]近幾年對裸燕麥肽的功能進行了相關研究，其研究數(shù)據(jù)顯示燕麥肽可在一定程度上緩解小鼠運動性疲勞，長期的燕麥低聚肽干預具有增強免疫力[27]和降低三高的作用[28]。但就目前的研究現(xiàn)況看，我國對于高附加值燕麥產(chǎn)品的開發(fā)仍處于較低水平。

1.4 果蔬類活性肽

除上述的大豆、大米、燕麥外，國內(nèi)外科研人員還對水果和蔬菜中存在的活性肽進行了研究，從中提取的多種活性肽已被證明具有抗氧化、抗炎、抗癌等生理活性。如許金光等[29]用胰蛋白酶酶解軟棗獼猴桃得到多肽，通過小鼠免疫試驗，發(fā)現(xiàn)其具有增強小鼠機體免疫功能的作用；Noh 等[30]從柑桔果實中分離鑒定環(huán)肽citrusin XI，并利用RAW264.7 炎癥模型證明其可通過抑制NF-KB 通路而降低iNOS 和NO 的產(chǎn)生，得出環(huán)肽citrusin XI 具有抗炎作用，可作為預防和治療炎癥性疾病的新藥物設計中的先導化合物；Moronta 等[31]研究發(fā)現(xiàn)從莧菜中分離得到的蛋白活性肽SSEDIKE 可抑制人結腸癌細胞Caco-2 的趨化因子CCL20 的基因表達，具有抑制炎癥的免疫活性；董姣[32]通過活性追蹤的方式分離、鑒定苦瓜活性肽，并由MTT 細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)其對非小細胞肺癌有抗增殖活性。種類繁多的水果和蔬菜為各種功能肽的開發(fā)與研究提供了重要的來源，更多果蔬源活性肽的發(fā)現(xiàn)和新功能活性的研究，為實際生產(chǎn)及臨床疾病改善提供更多的契機。

2 植物源活性肽的分離與鑒定

目前對植物源活性肽的研究大多是提取功能肽、研究其功能活性，并加以應用。獲得植物源活性肽的步驟可總結為：①制備蛋白水解物；②對蛋白水解物進行多步分離純化以獲得目標活性組分；③對分離純化后所得活性肽進行鑒定和運用。

2.1 制備方法

蛋白肽的制備方法有多種，常見的有酶解法、微生物發(fā)酵法和人工合成法，不同方法適合不同目的，各有其優(yōu)缺點。

酶解法包括單一酶解和復合酶解，具有條件溫和、高效安全、營養(yǎng)成分易保留和控制等優(yōu)點，是最常用的制備方法。由于各種蛋白酶有其專一作用位點，同種蛋白質經(jīng)不同種蛋白酶、不同程度水解表現(xiàn)出的生物活性不同。某些植物蛋白中可能含有酶制劑而發(fā)生競爭性抑制，酶解產(chǎn)生的苦味肽會影響口感與風味，故使用酶解法時要根據(jù)不同底物選用合適的蛋白酶或不同的混合酶，并控制好工藝參數(shù)[33]。

微生物發(fā)酵法是指依靠菌種自身的胞外蛋白酶來分解底物蛋白，使蛋白質既能被降解，又能使多肽除去苦味肽，完成同步制備小分子活性肽的效果，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。目前國內(nèi)外研究較多的是用微生物發(fā)酵乳蛋白和大豆蛋白，但微生物發(fā)酵及代謝過程復雜，其作用機理尚未完全明確，存在產(chǎn)物難以控制且分離純化較困難等問題，目前能開發(fā)生產(chǎn)的菌株數(shù)量不多[34]。

人工合成法包括化學合成法和基因重組法，化學合成法是基于活性肽的氨基酸序列已知的前提下，從C 端逐漸向N 端添加目標氨基酸的過程，可分為固相合成法和液相合成法?；蛑亟M法是將攜帶了目的活性肽基因的供體轉染進受體后，目的基因整合到受體基因組中并完成基因產(chǎn)物的表達，屬于活性肽產(chǎn)生的過程。人工合成法產(chǎn)品純度高但成本高、產(chǎn)量低，目前僅局限于實驗室研究和要求高的醫(yī)療保健產(chǎn)品[35]。

近些年國內(nèi)外學者多采用復合酶水解、菌酶協(xié)同水解或物理法輔助酶解來提取植物源活性肽。使用多酶進行水解，利用不同酶對蛋白質的酶解特異性，可顯著提高蛋白質的水解度，而蛋白酶與微生物進行組合發(fā)酵水解蛋白質，具有良好的蛋白脫除效果。此外，采用超聲波、高壓力、高剪切力和微波輻射等物理法對植物蛋白進行預處理可除去雜質，對蛋白質和酶進行改性以提高酶解效率，多種方法結合具有協(xié)同增效作用。于笛等[36]通過胰蛋白酶和堿性蛋白酶分段水解，制備了燕麥麩抗炎肽；鄒俊哲等[37]使用菌種聯(lián)合蛋白酶共同水解大米蛋白，發(fā)現(xiàn)大米肽水解溶出率高且具有良好的ACE 抑制活性；楊希[38]利用超聲波技術對米渣蛋白進行改性，進而利用多酶復合水解米渣蛋白以獲取大米蛋白活性肽；李榮等[39]在微波輔助的條件下，利用堿性蛋白酶和風味蛋白酶分步對紫蘇餅粕蛋白進行水解以制備鮮味肽。

2.2 分離純化

蛋白質水解產(chǎn)物一般是多種肽段、游離氨基酸、酶和未水解蛋白質的混合物，活性效果往往是各種組分活性協(xié)作的結果，需要進一步借用各種分離技術手段對酶解產(chǎn)物進行分離純化，以得到不同肽段的分級產(chǎn)物。

植物源活性肽的分離純化技術有許多種，主要的是超濾和色譜分離兩種。其中超濾膜分離和凝膠過濾色譜是根據(jù)肽的分子質量大小分別進行粗分離和精分離，離子交換色譜和反相高效液相色譜則分別利用樣品帶電性以及在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離。不同的分離純化技術各有其適用范圍和優(yōu)缺點。超濾是一種加壓膜分離技術，通過特制濾膜截留不同分子量的組分而使多肽得到粗分離，實現(xiàn)溶液的純化或濃縮，具有操作簡便、能保持物質完整性等優(yōu)點，但由于濃差極化、膜孔堵塞及凝膠層出現(xiàn)等因素的影響,膜通量會隨運行時間的延長而降低；疏水作用色譜法是根據(jù)蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水層析介質疏水表面可逆的相互作用來分離蛋白，其試驗條件溫和，可將未經(jīng)離子交換柱的樣品純化，并能有效地保持肽的生物活性，但需要根據(jù)不同蛋白樣品摸索合適的純化條件。離子交換色譜法是在中性條件下，利用組分離子與固定相親合力差異來實現(xiàn)分離，可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，適用于氨基酸、核酸、蛋白質等生物物質的分離，該法用到的洗脫液離子濃度、鹽濃度等對純化影響較大；凝膠過濾色譜法又稱分子排阻色譜法，是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對分離一些較大聚集態(tài)的分子更為方便，分子量較大的肽或蛋白均可以用此法分離；反相高效液相色譜法是由非極性固定相和極性流動相組成的液相色譜體系，不同化合物因其疏水性不同而得以分離，該方法具有柱效高、應用范圍廣、自動化程度高等優(yōu)點，適于分離非極性、極性或離子型化合物，但在分離多肽時首先需要確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。綜上，選擇分離純化的方法時，應根據(jù)待分離活性肽的物理、化學特性來選擇最合適的分離純化手段，還要從樣品的處理量、回收率、分離一次所需時間、分辨率以及活性保留等方面來綜合考慮，最好是進行多步分離純化[33]。

2.3 鑒定與分析

蛋白水解物經(jīng)分離純化得到目標肽段后，還需進一步的鑒定與分析以明確其一級結構與生物活性功能，這樣得到的才是嚴格意義上的生物活性肽。肽的一級結構是指肽鏈中氨基酸的序列，它是肽復雜空間結構和功能性質的基礎，有研究表明蛋白質的生物有效性與其氨基酸含量、氨基酸序列及空間結構等具有較大的相關性。植物源活性肽的構效關系是研究關注的熱點之一，目前主要是通過質譜技術來測定所得肽段的氨基酸序列，較多使用高效液相色譜-串聯(lián)質譜（HPLC-MS/MS）和基質輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質譜（MALDI TOF-MS/MS）來分析測定組分的氨基酸序列[40]。

3 植物肽的研究開發(fā)現(xiàn)狀

3.1 目前研究的方向

植物蛋白通過適當水解及分離純化得到植物源活性肽，理化性質和功能均有明顯改善。肽的生物學應用在很大程度上取決于其大小和結構，在靶組織中的吸收和生物利用度也起著至關重要的作用。植物源活性肽的營養(yǎng)質量受消化程度、氨基酸譜和生物利用度的共同影響，功能活性受氨基酸組成和空間構象的影響，故對于植物源活性肽的營養(yǎng)價值和功能評價不能簡單地從所含氨基酸的種類和數(shù)量上看，還應了解活性肽在靶器官系統(tǒng)循環(huán)中的消化吸收特性及相關作用機制、生物利用度和安全性，這也是目前國內(nèi)外學者研究熱點之一。Martinez 等[41]報告了食物源生物活性肽在促進心血管健康的分子機制，對其在調節(jié)血管緊張、抗炎、氧化應激時的作用原理進行了研究；Zhang 等[42]使用類腸道Caco-2 細胞單層研究了具有降低膽固醇活性的大豆肽WGAPSL 的跨上皮運輸特性，試驗結果表明大豆肽WGAPSL 在模擬的胃和腸中消化后具有良好的穩(wěn)定性，Gly-Ala-Pro（GAP）是其完整吸收的重要部分；印虹等[43]通過meta 分析的方法探究生物活性肽對腸黏膜免疫的調節(jié)作用，得出生物活性肽對腸道SIg A 有一定的促分泌作用，同時能改善腸黏膜結構、減少腸道有害菌群數(shù)量和增強腸道生物屏障；SUN 等[44]指出食源性活性肽的功能評價與產(chǎn)品開發(fā)應考慮其在胃腸道的吸收利用情況，了解食物基質的化學和營養(yǎng)成分及其物理形式（例如液體、果泥、凝膠）對活性肽發(fā)揮其生理活性的影響；Selamassakul 等[45]通過鑒定八個糙米肽中與生物活性和風味特征相關的氨基酸序列，評估了由菠蘿蛋白酶水解所得的糙米肽的風味特性和生物學特性，指出探索有關肽的氨基酸組成和空間構象，有助于更好地了解糙米肽在工業(yè)應用中的生物活性和風味所涉及的分子機制。目前研究者的關注點主要在于了解植物源活性肽的構效關系、增加活性肽在實際生產(chǎn)中的穩(wěn)定性和安全性，對其風味特征鮮有研究。植物源活性肽具有作為保健食品和飲料產(chǎn)品中功能性食品成分的潛力，可以為食品帶來良好的口感，相信植物源活性肽的功能活性與風味特征的關系探索也將是日后的一大研究趨勢。

3.2 應用現(xiàn)狀

肽的滲透壓小于氨基酸，可被機體直接吸收。在臨床營養(yǎng)支持中，肽的吸收和消化快于氨基酸和蛋白質，且不容易導致過敏，具有較好的感官效應。植物源活性肽因其具有營養(yǎng)全面、吸收安全、特殊生理功能活性和良好加工性能等優(yōu)點，可用于營養(yǎng)學、藥學、生理學等方面[46]，目前在飼料生產(chǎn)、功能食品、藥品、化妝品等行業(yè)均有應用。將植物源活性肽應用于動物日糧中，可促進動物的養(yǎng)分利用率和生產(chǎn)性能。將植物源活性肽應用于特殊醫(yī)用配方食品中，可滿足進食受限、消化吸收障礙及術后人員等人群的每日蛋白來源的營養(yǎng)需要，起到特殊的功能調節(jié)作用。目前已有植物蛋白肽粉對肝硬化型低蛋白血癥的療效以及對Ⅳ期胰腺癌患者營養(yǎng)狀態(tài)的改善效果等相關研究[47-48]，開發(fā)的食用產(chǎn)品有大豆蛋白肽營養(yǎng)粉/口服液、巴旦木蛋白肽米粉、蛋白肽保健果凍等[49-50]。但食源性多肽在食品工業(yè)中大部分是以酶解法制備的分子量大小不一的多肽混合物，其具體的功能片段還未能得到很好的提取和應用，故植物源活性肽的商業(yè)化生產(chǎn)及應用并未得到很好的推廣。

4 植物肽未來的研究及發(fā)展方向

食源性植物種類眾多，相比于動物蛋白，植物蛋白價格低更易獲取，具有分散性好和易消化等優(yōu)點。植物源活性肽安全性高，功能活性顯著，在食品、動物飼料和藥妝等領域有廣闊的應用前景和價值，是未來可期的功能因子[51]。植物源活性肽的研究主線是提取功能肽，研究其功能性，將功能肽配以其它輔料開發(fā)特定的功能產(chǎn)品。目前我國對于植物源活性肽的研究處于起步階段，總體上集中在功能肽的制備以及體外活性的測定上。而國外學者對于植物源活性肽的研究較早，研究的范圍也更廣泛，更多地關注了功能肽活性的體內(nèi)試驗及作用機制。

就目前發(fā)展狀況來看，植物源活性肽的功能性研究大多仍處于試驗階段，臨床應用較少，在實現(xiàn)生物活性肽的商業(yè)化生產(chǎn)問題上，還需科研人員進一步探索與研究。可從以下幾個方面展開：①通過現(xiàn)代科學技術篩選出高效、定向酶切用蛋白酶或微生物，攻克特殊蛋白酶切位點的暴露與隱藏的技術難關，對蛋白肽鍵進行靶向性酶解，以控制肽段的長度和保護特定的氨基酸序列，提高目標活性肽的純度和得率。②加強研究開發(fā)目標活性肽的快速分離純化技術，比如利用酶膜耦合法或微生物發(fā)酵與膜分離技術耦合法來提高肽的生產(chǎn)效率和分離速度。③利用分子模擬技術對目標活性肽的作用機理進行研究，為更好地利用與開發(fā)活性肽提供契機。用計算機的方法進行蛋白質水解的數(shù)學模擬、生物活性肽的生物勘探以及分子對接研究，通過定量構效關系建模的方法以了解肽的生理活性強度與化學結構信息間的相互關系，通過分子對接的方法以了解特定氨基酸序列的活性肽在機體內(nèi)的作用機制。④作為生物活性營養(yǎng)素應用時，要進一步研究目標活性肽在加工過程中的穩(wěn)定性以及與食物基質結合后進入胃腸道時的吸收利用情況[52]。⑤對所得植物源活性肽的風味特征與制備工藝、組成結構和生物活性三者之間的關系可做進一步探究，了解其在工業(yè)應用中的風味所涉及的分子機制。

近幾年國家已明確提出扶植發(fā)展生物活性肽產(chǎn)業(yè)的政策，有關植物源活性肽的研究日益活躍，其營養(yǎng)生理功能和產(chǎn)品化開發(fā)正逐漸受到重視。充分利用植物蛋白質資源，開發(fā)高價值的植物源功能肽并進行商業(yè)化生產(chǎn)將是未來發(fā)展肽的一大趨勢，具有廣闊的市場前景。