三葉青應(yīng)用及快速繁殖技術(shù)研究進(jìn)展

李靈，周芳美*

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg），又名石猴子、三葉扁藤、絲線吊金鐘等，葡萄科崖爬藤屬多年生常綠草質(zhì)蔓生藤本植物。其作為我國(guó)特有的珍稀中藥品種，是新“浙八味”之一，具有消炎止痛、清熱解毒、活血散結(jié)、祛風(fēng)化痰的功效[1]。此外，三葉青具有較高的園藝價(jià)值，可做室內(nèi)盆景，極具觀賞性。近年來(lái)由于三葉青抗病毒、抗腫瘤等功效的發(fā)掘[2]，市場(chǎng)需求量不斷增加，價(jià)格逐年攀升。過(guò)度采挖和馴化不足加劇三葉青野生資源的匱乏。繁殖體系優(yōu)化和資源開發(fā)成為三葉青應(yīng)用過(guò)程中的重要課題。本文就三葉青的種質(zhì)資源、臨床應(yīng)用、繁殖方式、栽培技術(shù)等方面的研究進(jìn)展作如下綜合論述。

1 種質(zhì)資源

三葉青為我國(guó)南方的特有物種，根據(jù)藤形態(tài)顏色、葉片邊緣鋸齒分為紫藤和青藤兩個(gè)品種，兩者生長(zhǎng)特性、繁殖方式大致相同，生長(zhǎng)地域分明，不混合生長(zhǎng)[3]。紫藤三葉青主要分布于37°18’以北的浙江、江西等地的山區(qū)，相比之下青藤品種分布更加廣泛，分布于27°18’以南的福建、湖南、四川、貴州、廣西、云南部分地區(qū)[4]。三葉青植物為陰生植物，喜斑駁光照，多生于海拔300～1000m山谷、灌叢、石壁陰濕處等環(huán)境中，蔭庇度40%～50%，年均溫度在16～22℃；忌陽(yáng)光暴曬，忌積水，忌霜凍，喜肥沃疏松富含腐殖質(zhì)的砂質(zhì)土[5]?？共∧芰?qiáng)、蟲害少，陰濕環(huán)境可鋪地栽植，覆蓋率以及成活率均較高。三葉青為多年生植物，繁殖速度慢，種子產(chǎn)量稀少。農(nóng)家生產(chǎn)常自繁自用、只種不選，多采用無(wú)性扦插繁育，導(dǎo)致三葉青種質(zhì)逐漸退化。隨著三葉青研究的深入，其更多藥理作用將被挖掘，市場(chǎng)需求量將越來(lái)越高，進(jìn)而加劇供需缺口。屆時(shí)，三葉青可能成為珍稀野生藥材原料。尋找一種快速、高效的三葉青繁殖技術(shù)是當(dāng)務(wù)之急。

2 生物活性研究

2.1 抗腫瘤作用

三葉青根多糖通過(guò)下調(diào)細(xì)胞中miR-151含量來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡[6]；總黃酮還可以有效抑制HepG2細(xì)胞，并呈時(shí)間、劑量依賴性地使HepG2細(xì)胞凋亡[7]；三葉青的塊根提取物異槲皮苷可以減少HGF誘導(dǎo)的親本或HGF/sf轉(zhuǎn)染的膀胱癌細(xì)胞株NBTII細(xì)胞的遷移和侵襲[8]。

2.2 抗病毒作用

三葉青萃取后的乙醇提取物正丁醇和乙酸乙酯有抗呼吸道合胞病毒活性的作用且明顯優(yōu)于利巴韋林[9]。劉江亭等[10]進(jìn)行體內(nèi)藥效試驗(yàn)后得出三葉青的塊根醇浸物中、大劑量可有效提高患甲型H1N1流感病毒性肺炎模型小鼠的存活率和肺指數(shù)抑制率。

2.3 抗氧化作用

孫永等[11]提取三葉青葉片及根部的成分得出其可降低大鼠體內(nèi)MDA含量，使SOD、T-AOC水平升高，同時(shí)使GSH含量升高，從而顯著增強(qiáng)大鼠自身的抗氧化能力。何文等[12]研究表明三葉青的黃酮類和酚類提取物可能是其抗氧化功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.4 抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用

現(xiàn)代藥理試驗(yàn)顯示，三葉青富有鎮(zhèn)痛消炎功效，臨床表明其可有效緩解小兒外感高熱，即起到解熱作用[13]。黃有強(qiáng)等[14]得出三葉青多糖可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，并使巨噬細(xì)胞中炎性因子TNF-α、IL-6含量顯著降低。

2.5 護(hù)肝作用

三葉青提取成分還能有效保肝降酶和抗纖維化。三葉青提取物乙酸乙酯可顯著抑制HBsAg和HBeAg的分泌，阻止HBV-DNA的復(fù)制，為量效、時(shí)效關(guān)系。

3 臨床應(yīng)用

臨床上，三葉青可應(yīng)用于肝癌、宮頸癌、肺癌、白血病、艾滋病等多種疾病的救治，被譽(yù)為安全無(wú)毒性的“植物抗生素”。史奎鈞[15]臨床應(yīng)用“振元抑瘤方”治療惡性淋巴瘤，此方具有扶正固本、清熱化痰、解毒散結(jié)、養(yǎng)陰益氣的功效。杜琪威等[16]研究表明三葉青通過(guò)降低LC3蛋白表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞保護(hù)性自噬，對(duì)散結(jié)抗癌方聯(lián)合新輔助化療具有一定療效。三葉青提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖起有效抑制作用，可通過(guò)上調(diào)P53及Bax蛋白表達(dá)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，下調(diào)MMP-2、MMP-9影響Hela細(xì)胞遷移、侵襲[17]。

4 現(xiàn)代繁殖技術(shù)

目前野生三葉青資源流失匱乏，屬于瀕危珍稀藥用植物[18]，馴化程度不高，嚴(yán)重影響了三葉青產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此優(yōu)化繁殖技術(shù)以及發(fā)展新品種選育刻不容緩。近年來(lái)三葉青繁殖體系得到快速發(fā)展，如組培快繁、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因等多種現(xiàn)代繁殖途徑，為保護(hù)三葉青資源提供了技術(shù)支持。

4.1 扦插繁殖

扦插為三葉青最普遍的繁育技術(shù)，其操作簡(jiǎn)易、管理方便。扦插基質(zhì)、插穗類型、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類等均對(duì)三葉青的繁育有顯著影響。趙富群等[19]創(chuàng)制在水溶液中扦插培育三葉青的方式，與組培相比極大降低了成本，便于管理，與傳統(tǒng)扦插相比不受季節(jié)影響，且添加植物生長(zhǎng)素IAA可以達(dá)到快速生根目的；洪霞等[20]利用立體限根栽培模式對(duì)三葉青帶芽莖段進(jìn)行扦插，研究發(fā)現(xiàn)采用控根容器進(jìn)行繁育時(shí)，每個(gè)容器為2株時(shí)總產(chǎn)量較低，當(dāng)每桶3株時(shí)有較高存活率，隨后密度越大，存活率下降，此外該研究認(rèn)為帶葉片的莖段可進(jìn)行蒸騰，防止插條腐爛，顯著提高存活率。

4.2 組培快繁

組織培養(yǎng)又叫離體培養(yǎng)，目前該技術(shù)快速發(fā)展，不斷得到優(yōu)化完善。植物激素的選擇對(duì)三葉青的組培發(fā)育起到極為關(guān)鍵的影響。洪春桃等[21]針對(duì)三葉青的腋芽誘導(dǎo)以及不定芽誘導(dǎo)體系進(jìn)行優(yōu)化，得出滅菌的腋芽莖段為最佳外植體，25%活性炭+0.5 mg/L 6-BA+1/2MS為最適腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS+0.2mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA為最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。史清英等[22]將印度梨形孢接種至三葉青組培幼苗根部，有效促進(jìn)了三葉青前期的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收以及抗逆性。

不少研究也提及三葉青組織培育過(guò)程中外植體的選擇和處理。羅常榮等[23]針對(duì)組培外植體的消毒方法進(jìn)行研究得：以三葉青莖段腋芽為外植體，75%乙醇浸泡5 min，0.1%氯化汞震蕩10 min為最適消毒方法。王靜[24]等研究表明帶腋芽3～8節(jié)的半木質(zhì)化莖段作為外植體效果好于帶芽莖尖。目前還有利用液體懸浮培養(yǎng)、誘導(dǎo)出三葉青愈傷組織的方法，向倩倩等[25]利用發(fā)根農(nóng)桿菌株系C58C1成功誘導(dǎo)出三葉青毛狀根，且生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

5 栽培技術(shù)

5.1 栽培模式

三葉青栽培模式主要包括仿野生林下栽培、大棚栽培以及大田栽培。倪川等[26]研究發(fā)現(xiàn)大棚栽培的三葉青光合能力和生長(zhǎng)情優(yōu)于林下栽培的三葉青，郁閉度60%～70%的闊葉林下用控根容器栽培的三葉青光合性能和葉片形態(tài)最佳。

5.2 栽培基質(zhì)

三葉青宜種植在土質(zhì)肥沃疏松、排水性能好的微酸性背陽(yáng)林地。林秀明等[27]進(jìn)行林下仿生栽培技術(shù)時(shí)得出栽培基質(zhì)中蛭石、黃土、珍珠巖、有機(jī)肥和泥炭以2∶2∶1∶3∶2的配比種植三葉青效果最佳。

5.3 田間管理

三葉青管理較粗放，除草時(shí)應(yīng)避免傷及根系。夏季溫度過(guò)高可通過(guò)霧狀噴灌，低溫可用稻草、樹枝覆蓋保暖防寒。可適當(dāng)施草木灰，促進(jìn)腋芽生長(zhǎng)。三葉青病蟲害較少，霉菌病可噴施硫菌靈。

6 展望

三葉青含有黃酮、多糖等多種有效活性成分，全株和全草可入藥，集抗腫瘤、抗病毒、解熱化瘀、消炎鎮(zhèn)靜、護(hù)肝等眾多療效于一體，兼具安全無(wú)毒性的特點(diǎn)，為最理想的廣譜“植物抗生素”，同時(shí)可作為觀賞性盆景，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、社會(huì)價(jià)值和生態(tài)效益。由于三葉青的生存條件要求嚴(yán)苛，喜陰濕、喜散射光，加上生長(zhǎng)緩慢和人為毀滅性挖掘，近年來(lái)三葉青數(shù)量銳減，遠(yuǎn)不能滿足三葉青產(chǎn)業(yè)發(fā)展和市場(chǎng)需求量。因此有必要優(yōu)化現(xiàn)代三葉青快速繁殖技術(shù)和先進(jìn)栽培技術(shù)，這對(duì)于三葉青資源的保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于三葉青快速繁殖技術(shù)研究仍較少，研究者多采用傳統(tǒng)的扦插技術(shù)培育三葉青。此外，人們?nèi)狈?duì)三葉青種植資源現(xiàn)狀的深入探索。因此有必要廣泛收集三葉青的種植資源，不斷改進(jìn)、優(yōu)化三葉青快速繁殖體系，從而有效改善三葉青種植資源緊缺、馴化不足的現(xiàn)狀。組培技術(shù)是進(jìn)行三葉青快速繁殖的有效途徑，具有較大的發(fā)展?jié)摿Γ型麑?shí)現(xiàn)三葉青大批量、規(guī)模化生產(chǎn)。此外，轉(zhuǎn)基因、理化誘變等創(chuàng)新研究成功培育出三葉青優(yōu)質(zhì)新品種。相信憑借三葉青藥效的普及應(yīng)用，加之現(xiàn)代先進(jìn)繁育技術(shù)的輔助，三葉青經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益必定會(huì)得到充分有效的開發(fā)利用。