病理性瘢痕及正常皮膚中成纖維細(xì)胞CD90表達(dá)情況的研究

楊炳林，肖 堅，陳昌明，陳文新，王合兵

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬三明第一醫(yī)院 乳腺外科，福建 三明，365000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬三明第一醫(yī)院 病理科，福建 三明，365000）

病理性瘢痕主要是指皮膚受損的患者創(chuàng)面異常愈合，可以分為瘢痕疙瘩和增生性瘢痕，尤其是增生性瘢痕，有潮紅充血表現(xiàn)，患者存在瘙癢或灼痛感，往往持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年后才能發(fā)生變化[1]。瘢痕疙瘩呈現(xiàn)紅褐色，質(zhì)地硬，無法自愈。影響患者皮膚美觀性，造成患者生活質(zhì)量降低。預(yù)防病理性瘢痕需要加強(qiáng)發(fā)生機(jī)制研究。CD90作為糖蛋白，通過甘油二酯C末端在細(xì)胞膜胞漿面附著，組成細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞增殖、凋亡、粘附等活動，達(dá)到信號傳導(dǎo)的作用，和創(chuàng)面愈合有著重要作用[2]。為了研究瘢痕皮膚和正常皮膚CD90表達(dá)差異，本文于本院2019年3月～2020年3月的皮膚樣本中，隨機(jī)選取30例分析：

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

取我院手術(shù)切除的病理性瘢痕15例，瘢痕皮膚邊緣位置的正常皮膚15例，經(jīng)過組織切片后，作為觀察組和對照組。性別：男/女=16/14，年齡（35.27±4.19）歲?；颊咧g具有可比性（P＞0.05）。納入與排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）觀察組皮膚樣本存在持續(xù)性發(fā)紅、疼癢等癥狀，未經(jīng)過冷凍、激光等方式治療。供者無器官功能障礙，或者其他皮膚病。（3）對照組皮膚樣本健康，無皮膚病或異常情況。

1.2 試劑和儀器

使用胰蛋白酶（美國Gibco公司）、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清（美國Gibco公司）、α-SMA兔單克隆抗體（上海研生生化試劑有限公司）、CD90小鼠單克隆抗體（上海信裕生物科技有限公司）、Nikon生物光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）標(biāo)本制備 準(zhǔn)備正常皮膚和病理性瘢痕皮膚標(biāo)本，在手術(shù)室無菌環(huán)境中切取，制作為1cm×1cm×1cm的標(biāo)本。

（2）病理檢查 切除組織后去除結(jié)締組織，浸泡福爾馬林48h，制作3mm×3mm×3mm的標(biāo)本組織，浸蠟包埋。使用酒精和二甲苯脫蠟入水。使用蒸餾水清洗，使用明礬蘇木素進(jìn)行染色，8min后清洗浮色。添加1%鹽酸分色，沖洗半小時后，使用氨水清潔一次。添加0.5%伊紅溶液進(jìn)行染色3min，使用清水清潔浮色。使用酒精脫水后，分化顏色，使用中性樹膠進(jìn)行封片處理。

（3）檢測成纖維細(xì)胞CD90表達(dá)情況 手術(shù)切除后，將皮下結(jié)締組織去除，浸泡在福爾馬林中保存48h。制作為3×3×3mm的樣本，浸蠟包埋，形成3μm厚度切片。在載玻片上刷涂多聚賴氨酸，將石蠟切片貼附，在60℃環(huán)境中經(jīng)過2h烘烤。使用純二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，經(jīng)過水化后，反復(fù)使用PBS沖洗三次，3min/次，使用微波抗原進(jìn)行修復(fù)。滴加過氧化氫甲醇液后，將過氧化物酶阻斷，在常溫下進(jìn)行10min孵育。再次使用PBS進(jìn)行三次沖洗，每次需要持續(xù)3min。添加動物血清50μl，在室溫環(huán)境中進(jìn)行10min孵育。將血清甩去后，添加一抗50μl進(jìn)行室溫孵育1h。再次使用PBS進(jìn)行重復(fù)三次沖洗，持續(xù)9min。滴加抗生物素過氧化物酶，進(jìn)行10min孵育，使用PBS沖洗三次，持續(xù)3min。將PBS液甩去，滴加DAB顯色液，觀察顯色反應(yīng)，觀察位棕色時，細(xì)胞為陽性。停止顯色反應(yīng)后，使用蒸餾水進(jìn)行沖洗，使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，使用鹽酸分化，并使用PBS沖洗至返藍(lán)。添加酒精脫水干燥，使用樹膠封固處理。由兩位資深病理科醫(yī)師使用顯微鏡對CD90進(jìn)行觀察，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評估。CD90細(xì)胞呈現(xiàn)出棕色為陽性。

（4）病理性瘢痕成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 取標(biāo)本結(jié)締組織后進(jìn)入DMEM基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室。使用生理鹽水進(jìn)行反復(fù)沖洗標(biāo)本，在適量DMEM培養(yǎng)基中切去標(biāo)本，在培養(yǎng)瓶底擺放，添加培養(yǎng)液半封閉。每間隔10h翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。5～7d更換培養(yǎng)液，然后每間隔3d更換一次。選擇2～3代培養(yǎng)細(xì)胞制作單細(xì)胞懸液，經(jīng)過離心處理后去除上清液，保存在液態(tài)罐中。

（5）觀察結(jié)果 使用顯微鏡在中倍鏡視野下觀察并攝像，判斷蛋白表達(dá)情況。將細(xì)胞標(biāo)本放置于激光掃描儀上，選擇488nm紫外線波長激發(fā)FITC，543nm紫外線波長激發(fā)TRITC，405nm紫外線波長激發(fā)DAPI。計算熒光值。對單細(xì)胞進(jìn)行多層次掃描，鎖定目標(biāo)細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)，使用t和χ2檢驗(yàn)資料，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組成纖維細(xì)胞CD90 表達(dá)熒光定量結(jié)果對比

對照組CD90表達(dá)熒光定量（34.19±1.53）。觀察組CD90表達(dá)熒光定量（30.12±2.65）。與對照組對比，差異顯著（P＜0.05），詳見表1：

表1 兩組成纖維細(xì)胞CD90 表達(dá)熒光定量結(jié)果對比

2.2 兩組成纖維細(xì)胞CD90 表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果對比

在15例病理性瘢痕樣本中，有9例（60.0%）可以發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞，高于正常皮膚2例（13.3%）。正常皮膚陽性細(xì)胞體積小，觀察組染色結(jié)果與對照組對比，差異顯著（P＜0.05）。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖2 A 增生性瘢痕，細(xì)胞間質(zhì)可見大量粗大陽性表達(dá)，膠原排列混亂（光鏡×400）；B 增生性瘢痕，基層纖維細(xì)胞和新生血管均存在陽性反應(yīng)細(xì)胞（光鏡×400）

3 討論

人體皮膚組織受到物理或者化學(xué)刺激后，形成缺損或者離斷后，內(nèi)皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞，能夠和細(xì)胞外的基質(zhì)產(chǎn)生作用，促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合[3]。創(chuàng)傷愈合可以分成創(chuàng)口收縮、形成肉芽以及覆蓋上皮三階段[4]。在創(chuàng)面修復(fù)形成肉芽組織階段，發(fā)生纖維化容易產(chǎn)生瘢痕，對患者皮膚美觀性、皮膚功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響[5]。瘢痕形成和諸多因素有關(guān)聯(lián)，如修復(fù)時間、皮膚色素、縫合技術(shù)等。從生物學(xué)角度，成纖維細(xì)胞也是形成瘢痕的主要因素，由于多種細(xì)胞因子參與創(chuàng)面愈合，造成愈合過程中，細(xì)胞因子會影響炎癥反應(yīng)時間，不利于創(chuàng)面愈合[6]。

瘢痕形成和細(xì)胞粘附分子有重要關(guān)系，細(xì)胞粘附分子是細(xì)胞間和細(xì)胞及基質(zhì)間結(jié)合分子，通過受體-配體結(jié)合方式發(fā)揮出作用，促進(jìn)細(xì)胞間、基質(zhì)間形成粘附，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖和分化等生理反應(yīng)[7]。胞外基質(zhì)和整合素相結(jié)合，能夠激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，成纖維細(xì)胞整合素表達(dá)水平更高。CD90是最小的一種免疫球蛋白，屬于粘附分子中的一種，質(zhì)量約為25000[8]。通過DAG C末端附著細(xì)胞膜，組成粘附結(jié)構(gòu)重要的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，經(jīng)過生長因子、細(xì)胞因子等，在成纖維細(xì)胞凋亡、粘附等過程中發(fā)揮作用，和創(chuàng)面愈合有著密切關(guān)聯(lián)[9]。CD90表達(dá)為部分的成纖維細(xì)胞，目前在人體眶周細(xì)胞、肺部細(xì)胞以及子宮肌層細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞。有研究通過分離小鼠的肺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD90存在陰性大群和陽性大群，兩者發(fā)揮著重要作用[10]?？梢奀D90表達(dá)可以作為病理性瘢痕的特異性指標(biāo)。

經(jīng)本文研究，對照組CD 90 表達(dá)熒光定量（34.19±1.53）。觀察組CD 90 表達(dá)熒光定量（30.12±2.65）。與對照組對比，差異顯著（P＜0.05）。在15 例病理性瘢痕樣本中，有9 例（60.0%）可以發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞，高于正常皮膚2例（13.3%）。正常皮膚陽性細(xì)胞體積小，觀察組染色結(jié)果與對照組對比，差異顯著（P＜0.05）?？梢娫诓±硇择：劢M織中，CD90表達(dá)水平明顯高于正常皮膚，正常皮膚CD90表達(dá)量明顯減少。

有學(xué)者提出CD90表達(dá)和α-SMA存在共表達(dá)性的特點(diǎn)，兩者存在協(xié)同作用。受到TNF和IL-1的刺激作用，CD90陽性表達(dá)顯著減少，甚至完全消失[11]。目前尚不能得出CD90表達(dá)對病理性瘢痕成纖維細(xì)胞功能造成的影響。未來還需要增加樣本量，通過mRNA測定的方法明確正常皮膚和瘢痕皮膚的表達(dá)差異。本研究中使用組織芯片方法，操作便捷，實(shí)驗(yàn)效率高，能夠控制實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，具有突出優(yōu)勢，可以廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究中[12]。在臨床實(shí)踐中，通過皮膚樣本CD90表達(dá)檢測，能夠初步判斷形成病理性瘢痕的風(fēng)險，根據(jù)檢測結(jié)果提前預(yù)防，有助于降低病理性瘢痕的形成，提高治療效果。

本研究通過免疫組織化學(xué)分析和病理學(xué)檢測對病理性瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行探索，為病理性瘢痕的防治建立了理論基礎(chǔ)。未來還需要進(jìn)一步探索臨床防治病理性瘢痕，對皮膚創(chuàng)傷患者給予有效治療，預(yù)防形成皮膚瘢痕，提高患者皮膚美觀性和功能。

綜上所述，成纖維細(xì)胞是病理性瘢痕的來源，存在CD90表達(dá)量多的特異性特點(diǎn)，通過使用組織芯片檢驗(yàn)，可提前預(yù)防病理性瘢痕的形成，有助于改善臨床療效，減輕患者心理負(fù)擔(dān)，提高整形治療效果。