HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒柴桂退熱顆粒中6個(gè)成分的含量

溫曉露 王群明

摘 要：測(cè)定小兒柴桂退熱顆粒中6個(gè)成分含量的方法，結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為小兒柴桂退熱顆粒中含量測(cè)定的檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：HPLC;小二柴桂顆粒;成分

DOI：10.12249/j.issn.1005-4669.2020.25.316

小兒柴桂退熱口服液是由柴胡、桂枝、葛根、浮萍、黃芩、白芍和蟬蛻7味藥材制備而成的中藥復(fù)方制劑，具有發(fā)汗解表、清里退熱之功效，臨床用于小兒外感發(fā)熱等癥?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部含量測(cè)定項(xiàng)下僅以葛根中葛根素含量作為該制劑質(zhì)量控制指標(biāo)，未對(duì)方中君、臣藥材的柴胡、桂枝的活性成分含量進(jìn)行質(zhì)量控制。目前，對(duì)小兒柴桂退熱口服液的研究多是針對(duì)其與其他藥物在臨床上的聯(lián)合應(yīng)用，但尚未有多種活性成分含量同時(shí)測(cè)定的研究報(bào)道。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，臨床療效的發(fā)揮是多種成分協(xié)同作用，多成分含量同時(shí)測(cè)定可以彌補(bǔ)單一成分對(duì)制劑質(zhì)量控制的不足。為提高該制劑的質(zhì)量控制水平，本研究建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒柴桂退熱顆粒中6個(gè)有效成分的含量測(cè)定方法，為提高小兒柴桂退熱顆粒的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器（用于各檢測(cè)成份波長(zhǎng)的選擇）;Shimadzu 高效液相色譜儀，包括Shimadzu LC-20ATVP泵，Shimadzu SPD-20AVP 紫外檢測(cè)器，CTO-20A 柱溫箱，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器（用于方法學(xué)考察和含量測(cè)定）。Mettler AE 240天平，寧波科生儀器廠KS-300E超聲波清洗器。

葛根素對(duì)照品（批號(hào)110752-200912）、大豆苷對(duì)照品（批號(hào)111738-200501）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715-201016，95.2%）、大豆苷元對(duì)照品（批號(hào)111502-200101）、桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)111595-200604）和黃芩素對(duì)照品（批號(hào)111595-200604）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。A、B廠家共12批樣品均為自購(gòu)。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

1）溶液制備。（1）對(duì)照品儲(chǔ)備液及混合對(duì)照品溶液精密稱(chēng)。取各對(duì)照品適量，制成0.6200mg·mL-1葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液，0.2104mg·mL-1大豆苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，0.5503mg·mL-1黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，0.2076mg·mL-1大豆苷元對(duì)照品儲(chǔ)備液，0.01139mg·mL-1桂皮醛對(duì)照品儲(chǔ)備液，0.1996mg·mL-1黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制成含葛根素0.1240mg·mL-1、大豆苷0.04208mg·mL-1、黃芩苷0.05503mg·mL-1、大豆苷元0.02076mg·mL-1、桂皮醛0.004556mg·mL-1、黃芩素0.007984mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。（2）黃芩素對(duì)照品溶液精密量取黃芩素對(duì)照品。儲(chǔ)備液2mL，置50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得含黃芩素0.007984mg·mL-1的溶液，即得。（3）供試品溶液取小兒柴桂退熱顆粒2袋，研細(xì)、混勻，精密稱(chēng)取約1g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲（300W，40kHz）提取30min，放冷，再稱(chēng)定，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。（4）陰性對(duì)照溶液按處方中藥味的比例制成。缺葛根、黃芩、桂枝的陰性對(duì)照樣品100g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2）色譜條件。色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），線性梯度洗脫（0～5min，93%B;5～20min，93%B→89%B;20～23min，89%B→85%B;23～30min，85%B→83%B;30～35min，83%B→77%B;35～50min，77%B→52%B;50～53min，52%B→15%B;53～55min，15%B），流速1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm（0～35min，測(cè)定葛根素和大豆苷）、270nm（35～48min，測(cè)定黃芩苷和大豆苷元）、290nm（48～50.5min，測(cè)定桂皮醛）、278nm（50.5～55min，測(cè)定黃芩素），流速1.0mLmin-1，柱溫40℃;供試品溶液、陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣量3μL，對(duì)照品溶液進(jìn)樣量5μL。在上述色譜條件下，小兒柴桂退熱顆粒中葛根素、大豆苷、黃芩苷、大豆苷元、桂皮醛、黃芩素6個(gè)成分分離良好，理論塔板數(shù)大于4000，分離度大于1.5，見(jiàn)圖1。

3）精密度考察。分別精密西區(qū)混合對(duì)照品溶液5μL，連續(xù)進(jìn)樣5詞，考查方法的精密度。結(jié)果葛根素、大豆苷，黃芩苷、大豆苷元、桂皮醛和黃芩素峰面積的RSD分別0.58%、0.22%、0.71%、0.72%和0.60%，表明儀器精密度良好。

4）重復(fù)性考察

測(cè)定6個(gè)成分的峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果樣品中葛根素、大豆苷、黃芩苷、大豆苷元、桂皮醛和黃芩素平均含量分別為3.456、0.4862、0.8949、0.1860、0.2588、0.004950mg·g-1，RSD分別為0.99%，1.2%，0.72%，1.4%，1.7%和1.0%，表明方法的重復(fù)性好。

3 討論

1）指標(biāo)成分的選擇。柴胡作為方中君藥，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣之功效，皂苷類(lèi)物質(zhì)在柴胡屬植物中含量最高，活性最強(qiáng)。桂枝中含有的主要活性成分為揮發(fā)油類(lèi)，其中桂皮醛70%～80%，這類(lèi)物質(zhì)具有發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈等功效，臨床常用于風(fēng)寒感冒、脘腹冷痛等癥。處方藥材中所含的黃芩苷具有抗菌、抗病毒的作用，黃芩作為中醫(yī)臨床和中成藥中最為常用的中藥之一，研究顯示，黃芩苷等黃酮類(lèi)化合物為黃芩的主要有效成分，具有解熱抗炎、抗腫瘤、解毒、保肝及調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。白芍屬于補(bǔ)虛藥，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛的功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷為其主要活性成分，而酚酸類(lèi)物質(zhì)沒(méi)食子酸具有抗氧化、抗炎、抗自由基等功能。為了更好地保證小兒柴桂退熱口服液的安全性和有效性，本文以葛根素、大豆苷、黃芩苷、大豆苷元、桂皮醛、黃芩素為指標(biāo)評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量，更全面合理。

2）流動(dòng)相的選擇。在流動(dòng)相的選擇上，以乙腈和水為流動(dòng)相，用相同的梯度洗脫方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有些峰拖尾較為嚴(yán)重;以乙腈和0.1%甲酸溶液、乙腈和0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基線漂移較為嚴(yán)重，可能是因?yàn)榧姿岷鸵宜嵩?50～290nm處有吸收。所以最終確定乙腈和0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，結(jié)果測(cè)定的圖譜基線平穩(wěn)，大多數(shù)色譜峰峰形較好。采用文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)條件，未達(dá)到理想的分離效果，采用本文的實(shí)驗(yàn)方法各個(gè)成分能夠?qū)崿F(xiàn)較好分離。最終確定本文所采用的實(shí)驗(yàn)方法，分離效果較好，能達(dá)到基線分離，且基線平穩(wěn)。

3）廠家的樣品含量比較及工藝改進(jìn)建議。從2個(gè)廠家的樣品含量比較分析來(lái)看，B廠樣品葛根指標(biāo)性成分含量略高，而A廠樣品黃芩和桂枝類(lèi)的指標(biāo)性成分含量較高。其中桂皮醛的含量差異最大。由于桂皮醛具有很強(qiáng)的揮發(fā)性，不同廠家制劑工藝不同，導(dǎo)致其含量差異較大，而桂皮醛具有多種藥理活性，建議廠家對(duì)桂枝的提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，可以將桂枝先提取揮發(fā)油，然后再將揮發(fā)油噴到成品的顆粒上。柴胡按性狀不同分為“南柴胡”和“北柴胡”，而藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制、儲(chǔ)存、生產(chǎn)工藝等因素可能會(huì)使含量差異較大。因此，在中藥制劑生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)對(duì)其原料來(lái)源、藥材質(zhì)量及制備工藝等進(jìn)行嚴(yán)格控制，以確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

參考文獻(xiàn)

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