Vishniacozyma carnescens PGLY-1的分離、鑒定及對(duì)梨青霉病的抑制作用評(píng)價(jià)*

馬 強(qiáng)，石雅君，李正男，王文輝，孫平平

（1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，呼和浩特010018）（2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所）

我國(guó)是世界上最大的梨生產(chǎn)國(guó)[1]，由擴(kuò)展青霉Penicillium expansum引起的梨青霉病是發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的梨采后真菌病害，給果農(nóng)和經(jīng)銷商造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病害在梨果運(yùn)輸、貯藏過(guò)程中均可發(fā)生，病原菌可經(jīng)傷口侵入，病果與健康果實(shí)也可通過(guò)接觸傳播，感病梨果肉由外向內(nèi)腐爛，果肉凹陷，在果實(shí)表面先產(chǎn)生白色菌絲，隨后產(chǎn)生青綠色、堆粉狀病菌孢子霉斑，且伴有強(qiáng)烈的發(fā)霉氣味[2]。另外，P.expansum產(chǎn)生的展青霉素具有致畸、致癌和免疫毒性，危害人體健康[3]。目前，針對(duì)青霉菌主要利用多菌靈、甲基硫菌靈、苯來(lái)特、噻苯咪唑等化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，但長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑會(huì)對(duì)人類健康和環(huán)境造成危害，且易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，從而降低防效[4]，因此對(duì)青霉病的綠色防控成為替代化學(xué)防控的主要措施。

利用拮抗微生物防治果蔬采后病害是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[5]，其中酵母菌作為安全、無(wú)毒、不污染環(huán)境、抗病強(qiáng)、繁殖快的有益微生物受到廣泛的關(guān)注。目前，在果蔬采后病害控制中效果較好的酵母菌主要有假絲酵母屬Candida、隱球酵母屬Cryptococcus、梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia、畢赤酵母屬Pichia、紅酵母屬Rhodotorula和絲孢酵母屬Trichosporon等[5-8]。然而，這些生防菌株遠(yuǎn)不能滿足我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求，篩選出更多具有較好防治效果的酵母菌仍然是當(dāng)務(wù)之急。內(nèi)蒙古地區(qū)氣候條件多樣、微生物資源豐富[9]，從該地區(qū)篩選出對(duì)病害具有抑制活性的酵母菌，將為植物病害的綠色防控提供更多的資源。目前，對(duì)從內(nèi)蒙古地區(qū)分離酵母菌的研究主要集中在奶制品、飼料、釀酒以及重金屬降解上[10-13]，利用酵母菌對(duì)植物病害進(jìn)行防治，僅見宋娟[14]篩選出Pichia anomalax6和Rhodotorula glutinisp2用于厚皮甜瓜采后病害防治的研究。由于研究者更容易從某一發(fā)病區(qū)域內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)良好的植物根基、葉表、體內(nèi)分離出具有很好生防效果的生防菌[15]，因此，本研究從內(nèi)蒙古地區(qū)廢棄果園中長(zhǎng)勢(shì)良好的‘蘋果梨’葉片上分離篩選到1株酵母菌，探究了該菌株對(duì)梨青霉病的防控效果，并確定了其分類地位。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇大小一致、無(wú)可見機(jī)械損傷的‘黃冠’梨果實(shí)30個(gè)左右，5 ℃貯藏備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、酵母膏蛋白胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；Ezup柱式酵母菌基因組DNA提取試劑盒、Sanprep柱式DNA凝膠回收試劑盒（SK8131）購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒、pMDTM19-T Vector克隆試劑盒，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

供試?yán)媲嗝咕鶳.expansum由作者在前期研究中分離得到[16]。將斜面保存的病原菌P.expansum轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，用于后續(xù)離體及活體試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1酵母菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定

2018年5月，在內(nèi)蒙古巴彥淖爾市廢棄的病害嚴(yán)重的‘蘋果梨’園內(nèi)，選取長(zhǎng)勢(shì)旺盛的‘蘋果梨’樹，采集4片葉片，裝入自封袋中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存。參照J(rèn)anisiewicz等[17]的方法對(duì)葉片上的酵母菌進(jìn)行分離，將葉片用無(wú)菌剪刀剪至1 cm×1 cm左右，置于25 mL含有0.05 mol/L、pH值6.8的磷酸緩沖液中，100 r/min搖床振蕩10 min，在超凈工作臺(tái)將洗液梯度稀釋10、100倍后，各取100 μL涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單個(gè)酵母菌落轉(zhuǎn)入YPD平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，用光學(xué)顯微鏡（LEICA ICC50W）觀察其細(xì)胞形態(tài)及無(wú)性繁殖方式，結(jié)合菌落形態(tài)對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2分離酵母菌對(duì)梨青霉病的活體抑制活性

在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)、配制酵母菌懸液和青霉菌孢子懸浮液。具體操作如下：用無(wú)菌水將YPD培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d的酵母菌液稀釋至濃度為106個(gè)/mL，制成酵母菌懸液；用無(wú)菌刀片刮取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的青霉菌孢子，再用無(wú)菌水稀釋至孢子濃度為108個(gè)/mL。參照Sadeghian等[18]的方法，用‘黃冠’梨測(cè)定分離酵母菌對(duì)梨青霉病的活體抑制活性，每個(gè)處理重復(fù)3次，每處理4個(gè)果實(shí)。將‘黃冠’梨果實(shí)于2%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗后晾干。用無(wú)菌打孔器在‘黃冠’梨果實(shí)赤道部位打5 mm（深）×3 mm（寬）的傷口，用移液器向傷口內(nèi)注入100 μL酵母菌懸液，放入鋪有濾紙的保鮮盒中，保鮮膜封口，20 ℃下保濕培養(yǎng)。以致傷后注入100 μL YPD培養(yǎng)液為對(duì)照。處理2 d后，在傷口處接種10 μL梨青霉菌孢子懸浮液，繼續(xù)保濕培養(yǎng)，分別在接種病原菌后第5、10、15、20、25 d觀察發(fā)病情況，采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑，并計(jì)算PGLY-1對(duì)梨青霉病的抑制活性。

抑制活性（%）=（1-處理病斑直徑/對(duì)照病斑直徑）×100

1.2.3分離酵母菌對(duì)梨青霉病的離體抑制活性

利用平板對(duì)峙法測(cè)定酵母菌對(duì)梨青霉菌的離體抑制活性。挑取培養(yǎng)5 d直徑為6 mm的青霉菌菌餅，置于直徑9 cm的PDA平板中央，并在距離青霉菌菌餅3 cm的2個(gè)相對(duì)方向，分別接種YPD平板上生長(zhǎng)3 d的待測(cè)酵母菌菌餅，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次，以不接種酵母菌的平皿為對(duì)照。待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿平板時(shí)，觀察并記錄抑菌圈直徑。

同時(shí)測(cè)定PGLY-1無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液對(duì)青霉菌的離體抑制活性。將在YPD平板上培養(yǎng)3 d的PGLY-1菌株轉(zhuǎn)入YPD培養(yǎng)液中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)5 d后，發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，取上清液。待融化的PDA溫度降至約50 ℃時(shí)，將100 mL PDA與10 mL PGLY-1發(fā)酵上清液混勻，倒入直徑9 cm的平板中，于平板中央接種青霉菌菌餅，然后在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。以不加酵母菌發(fā)酵液的PDA為對(duì)照，觀察并記錄青霉菌的菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.4ALY-1的分子鑒定

利用Ezup柱式酵母菌基因組DNA提取試劑盒提取ALY-1總DNA，采用通用引物NL1（GCATAT CAATAAGCGGAGGAAAAG）/NL4（GGTCCGTGTT TCAAGACGG）[19]對(duì)其26S rDNA D1/D2區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq酶（5 U/μL）0.5 μL、DNA（100 ng/μL）1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)平至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用Sanprep柱式DNA凝膠回收試劑盒（SK8131）回收純化，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到Escherichia coli菌株DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落，將PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性的單克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中的 T-test比較分析ALY-1對(duì)青霉病的活體抑制活性。使用Vector NTI Advance 11軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正，提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：MN483179）；用BLASTn程序?qū)π蛄羞M(jìn)行同源序列搜索；應(yīng)用MEGA 6.0軟件，采用ClustalW算法對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，用比鄰法（neighbor-joining，NJ），校正值設(shè)定為1 000，并以50%為閾值構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性酵母菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

從采集的‘蘋果梨’樹葉片上分離得到1株酵母菌株，編號(hào)為PGLY-1。PGLY-1菌落在YPD培養(yǎng)基上呈乳白色，菌落光滑、濕潤(rùn)、黏稠、容易挑起，顏色均勻一致。在40倍光學(xué)顯微鏡下，觀察到PGLY-1細(xì)胞呈卵圓形，無(wú)性繁殖方式為單邊出芽，具有典型酵母菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征（圖版4）。

2.2 分離酵母菌對(duì)梨青霉病的抑制活性

離體結(jié)合活體測(cè)定PGLY-1對(duì)梨青霉病的抑制活性，結(jié)果顯示，PGLY-1菌株及其無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液在離體條件下均對(duì)梨青霉菌無(wú)顯著抑制活性，但其菌懸液在活體條件下對(duì)梨青霉病的病斑直徑擴(kuò)展具有顯著的抑制作用?；铙w條件下，經(jīng)PGLY-1菌懸液處理的‘黃冠’梨在接種青霉菌后的病斑直徑均顯著小于對(duì)照，在測(cè)定的25 d內(nèi)PGLY-1對(duì)青霉病的活體抑制活性均在50%以上。接種5 d后PGLY-1處理的梨青霉病斑直徑為1.21 mm，顯著小于對(duì)照的 2.79 mm，對(duì)梨青霉病的抑制活性為56.63%；接種25 d后，PGLY-1處理的梨青霉病斑直徑為12.54 mm，極顯著小于對(duì)照的28.03 mm，對(duì)梨青霉病的抑制活性為55.26%（表1，圖1）。

表1 PGLY-1處理‘黃冠’梨青霉病斑直徑及抑制活性

圖1 酵母菌PGLY-1處理25 d后對(duì)青霉病的抑制情況

2.3 分離酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

以菌株P(guān)GLY-1的DNA為模板，對(duì)其26S rDNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為616 bp的目標(biāo)片段。采用Vector NTI Advance 11（Thermo Fisher Scientific，USA）軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正，并將校正后的結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：MN483179）。利用BLASTn進(jìn)行同源性序列搜索，選取相似性較高的Vishniacozyma屬的V.carnescens（EU194464、KT933344、AB035054）、V.tephrensis（DQ000318、KX507032 ）、V.heimaeyensis（DQ000317、JQ768868）、V.psychrotolerans（JN193444、JN193445）、V.taibaiensis（KP263768、AY557601）共11個(gè)代表菌株序列，并以隱球酵母屬的Cryptococcus diffluens（AF181543、KM085333）為外參序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，菌株P(guān)GLY-1與V.carnescens種的3個(gè)菌株聚集在同一支上（圖2），PGLY-1與V.carnescens代表菌株CBS973（AB035054）的26S rDNA基因的序列一致性達(dá)到100%，因此確定PGLY-1為Vishniacozyma carnescens。

圖2 基于26S rDNA序列構(gòu)建菌株P(guān)GLY-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

本研究從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市廢棄的‘蘋果梨’園內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)好的梨樹葉片上，分離到1株可顯著抑制梨青霉菌擴(kuò)展的酵母菌V.carnescens，該發(fā)現(xiàn)為內(nèi)蒙古地區(qū)酵母菌資源的利用提供了更多的基礎(chǔ)。V.carnescens原被歸為Cryptococcus屬，Liu等[20]于2015年對(duì)其進(jìn)行重新分類，將其歸為Vishniacozyma屬。Vishniacozyma屬酵母菌多在植物中被檢測(cè)到[21]，目前有從釀酒葡萄、落葉、果樹、土壤以及湖水中分離或鑒定到V.carnescens菌株的報(bào)道[22-27]，但是對(duì)其功能、應(yīng)用，尤其是病害防治等均未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)的V.carnescensPGLY-1能顯著抑制青霉病在梨果上的擴(kuò)展，該發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充了用于青霉病生物防治的微生物資源，同時(shí)也是對(duì)V.carnescens應(yīng)用的進(jìn)一步擴(kuò)展。

拮抗酵母菌主要通過(guò)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與空間競(jìng)爭(zhēng)、對(duì)病原菌直接寄生、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)直接作用于病原菌、誘導(dǎo)寄主抗性等多個(gè)方面對(duì)病原菌進(jìn)行防控[5]。目前，已經(jīng)報(bào)道的對(duì)果蔬貯運(yùn)過(guò)程中的青霉病具有抑制活性的酵母菌有：淺白隱球酵母C.albidus、黏紅酵母R.glutinis、橄欖假絲酵母C.oleophila、膜醭畢赤酵母P.membranaefaciens、季也蒙邁耶氏酵母Meyerozyma guilliermondii、葡萄汁有孢漢遜酵母Hanseniaspora uvarum、擬粉紅鎖擲孢酵母Sporidiobolus pararoseus、解脂耶羅威亞酵母Yarrowia lipolytica[28-36]等。其中，淺白隱球酵母和黏紅酵母可以通過(guò)在果實(shí)表面快速定殖與病原菌進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間競(jìng)爭(zhēng)來(lái)抑制病原菌的擴(kuò)展[28-29]。橄欖假絲酵母、膜醭畢赤酵母與季也蒙邁耶氏酵母通過(guò)與病原菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間競(jìng)爭(zhēng)，以及誘導(dǎo)寄主抗性來(lái)抑制青霉菌[30-33]。葡萄汁有孢漢遜酵母、擬粉紅鎖擲孢酵母和解脂耶羅威亞酵母，除了通過(guò)與病原菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性等方式外，還可以通過(guò)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)直接作用于致病菌[34-36]。本研究分離得到的V.carnescensPGLY-1的菌懸液，在活體條件下能夠顯著抑制梨青霉病的擴(kuò)展，但是菌株及其發(fā)酵液在離體條件下對(duì)青霉菌無(wú)顯著抑制作用。當(dāng)植物受到外源物質(zhì)誘導(dǎo)或者病原菌侵染時(shí)，體內(nèi)抗性相關(guān)酶及其基因的表達(dá)增強(qiáng)，這些抗性相關(guān)酶的表達(dá)在果實(shí)抗真菌病害的過(guò)程中具有十分重要的作用[37-38]。因此，V.carnescensPGLY-1在果實(shí)表面的定殖，對(duì)果實(shí)抗性相關(guān)酶以及相關(guān)基因表達(dá)的影響等抗病機(jī)制值得進(jìn)一步研究。