離子色譜兩種檢測(cè)器測(cè)定乳制品中亞硝酸鹽和硝酸鹽方法比較

文/梁 晨 鄭秀瑾 金曉曉 張錦梅 張苗苗

（青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司）

亞硝酸鹽和硝酸鹽廣泛存在于自然界中，亞硝酸鹽可與食物中的仲胺、叔胺和酰胺等胺類反應(yīng)結(jié)合成強(qiáng)致癌物亞硝胺，同時(shí)人體內(nèi)有一類細(xì)菌叫硝酸還原菌，它可使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，因此硝酸鹽往往表現(xiàn)亞硝酸鹽的毒性[1～3]。乳制品中的亞硝酸與硝酸鹽的含量往往是痕量的，但是新生嬰兒對(duì)兩種污染物特別敏感，食用亞硝酸鹽或含有硝酸鹽濃度高的食品可能導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥，表現(xiàn)為紫紺，甚至死亡。因此，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)嬰兒配方奶粉中這類物質(zhì)的含量有嚴(yán)格的規(guī)定，其中亞硝酸鹽的含量不得超過(guò)100.0 mg/kg，硝酸鹽的含量應(yīng)小于2.0 mg/kg[4～6]。嬰幼兒配方奶粉含有嬰幼兒發(fā)育過(guò)程中所必需的一切營(yíng)養(yǎng)成分，是嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的理想食品。一些嬰幼兒配方奶粉在生產(chǎn)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)了特殊的處理調(diào)制，使其蛋白質(zhì)組分更接近于母乳，但在這個(gè)過(guò)程中會(huì)加入大豆蛋白質(zhì)，從而帶進(jìn)來(lái)亞硝酸鹽的成分[7]。因此，檢測(cè)奶粉中的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量十分必要。

目前檢測(cè)亞硝酸鹽和硝酸鹽的方法有鎘柱還原-分光光度法[8，9]、分子熒光法[10]、光電檢測(cè)法[11]、氣相色譜法[12，13]、離子色譜-紫外線法[14]（IC-UV）、離子色譜-電導(dǎo)法[15]（IC-CD）等。其中鎘柱還原-分光光度法中，硝酸鹽采用鎘柱還原成亞硝酸鹽，再采用對(duì)氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺法測(cè)定或磺胺和N-1-1萘基-乙二胺二鹽酸鹽法測(cè)定亞硝酸鹽，由此得到亞硝酸鹽的總含量，再用亞硝酸鹽的總含量減去亞硝酸鹽的含量，即可得到樣品中的硝酸鹽含量。該方法需分步測(cè)定硝酸鹽和亞硝酸鹽，操作繁瑣，重現(xiàn)性差，且在試驗(yàn)過(guò)程中檢驗(yàn)人員需要接觸具有致癌性的鎘，對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作人員有潛在的危害，此外，分光光度法易受溶解的有機(jī)物及一些金屬離子的嚴(yán)重干擾。近些年來(lái)雖有報(bào)道在線透析和在線鎘柱還原-流動(dòng)注射光度法測(cè)定乳制品中的硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法[16]，但是仍有廢棄重金屬鎘產(chǎn)生，鎘對(duì)環(huán)境容易造成污染，處理較復(fù)雜。分子熒光法雖然較靈敏，但是樣品中干擾物的存在會(huì)增加或降低熒光強(qiáng)度導(dǎo)致相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差增大[17]。光電檢測(cè)法是將顯色的試紙條在光電檢測(cè)儀的感應(yīng)窗里檢測(cè)，具有簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，但重現(xiàn)性不好，定量結(jié)果不精確。氣相色譜法是先將樣品分離蛋白質(zhì)后，加入試劑將其制成硝酸鹽-2-S-丁酚化合物的五氟化苯甲酰酯的形式，或利用硫酸催化樣品中的硝酸離子與苯發(fā)生反應(yīng)生成硝基苯，最后用電子捕獲檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，該方法雖然可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)，但操作較復(fù)雜。IC-UV和IC-CD前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，分析快速，無(wú)有害物質(zhì)產(chǎn)生，重現(xiàn)性好，可同時(shí)進(jìn)行多組分測(cè)試[18]。本文對(duì)比兩種檢測(cè)方法，旨在建立適合于同時(shí)快速測(cè)定乳制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽且能普遍適用的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

CIC-D160型離子色譜儀，青島盛瀚色譜公司，配SHRF-10型氫氧化鉀淋洗液發(fā)生器、SHD-6恒溫電導(dǎo)池、色譜柱恒溫系統(tǒng)、SHY-6型陰離子連續(xù)自動(dòng)再生微膜抑制器、HW-2000型色譜工作站；U C-3 2 9 2 紫外檢測(cè)器；UPT-Ⅱ-20L型超純水機(jī)；Mettler Tole-do AL-104型電子天平；TG18-WS型離心機(jī)；KQ 2200型超聲波萃取儀；超濾杯；一次性有機(jī)系針式濾膜。

固相萃取柱：SPE IC-C18（1 mL）、SPE IC-Ag（1 mL）、SPE IC-Na（1 mL）青島盛瀚色譜公司。固相萃取柱使用前需要進(jìn)行活化，其活化過(guò)程為：C18小柱使用前依次用5 mL的甲醇及10 mL的超純水過(guò)柱，活化，然后放置10 min使之充分平衡；Ag柱和Na柱用10 mL水過(guò)柱，靜置活化10 min使之充分平衡。

1.2 樣品與試劑

冰乙酸（分析純）、乙腈（分析純），美國(guó) Sigma-Aldrich 公司；試驗(yàn)用水為超純水（電阻率小于18.25 MΩ·cm；NO2-、NO3-標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 000 mg/L（國(guó)防科技工業(yè)應(yīng)用化學(xué)一級(jí)計(jì)量站）；樣品為市售奶粉樣品。

1.3 離子色譜條件

S H-A C-1 1 陰離子色譜柱（250 mm×4.6 mm），SHAG-1（4 mm×50 mm）；淋洗液為淋洗液發(fā)生器產(chǎn)生的高純氫氧化鉀溶液，濃度為8 mmol/L，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量100 μL，柱溫和檢測(cè)器均為35 ℃；SHY-6型抑制器的抑制電流為50 mA，系統(tǒng)壓力4.7 Mpa；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)214 nm。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g奶粉于10 mL容量瓶中，先加適量超純水，再加3.00%乙酸1 mL，超聲30 min后，定容，靜置。取上述上清液用超純水稀釋10倍，8 000 r/min離心10 min。取上清液依次過(guò)活化后的C18固相萃取柱，Ag柱，Na柱，棄去前9 mL流出液，收集后面的洗脫液待測(cè)。再過(guò)0.45 μm的針式過(guò)濾頭后，上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子色譜中淋洗液的選擇及優(yōu)化

SH-AC-11陰離子色譜柱采用CIC-D160內(nèi)置淋洗液發(fā)生器，由純水在線產(chǎn)生的高純度氫氧化鉀作為淋洗液，操作簡(jiǎn)便，尤其是對(duì)復(fù)雜樣品檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì)。奶粉樣品中的氯離子含量較高，因此，試驗(yàn)設(shè)置了淋洗液濃度5 mmol/L、8 mmol/L、13 mmol/L、15 mmol/L，考察這4 個(gè)條件下亞硝酸鹽、硝酸鹽與雜峰離子的分離效果。當(dāng)淋洗液濃度低于8 mmol/L時(shí)，樣品中待測(cè)離子與其他雜峰分離效果分離較好，但分析測(cè)定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；當(dāng)淋洗液濃度高于8 mmol/L時(shí)，分析測(cè)定時(shí)間縮短，但實(shí)際樣品中含有大量氯離子，與亞硝酸鹽分離效果不佳。綜上所述，淋洗液濃度選用8 mmol/L。取亞硝酸鹽與硝酸鹽的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為1.00 mg/L，硝酸鹽為2.00 mg/L，在色譜條件下進(jìn)行測(cè)試，亞硝酸鹽與硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)及查閱資料對(duì)亞硝酸鹽與硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液掃描分析，在214 nm處測(cè)定時(shí)，不但干擾小，亞硝酸鹽和硝酸鹽的靈敏度也最高。因此，試驗(yàn)選擇214 nm作為紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)。

2.3 超聲提取時(shí)間優(yōu)化

圖1 電導(dǎo)檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器下標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

圖2 超聲提取時(shí)間對(duì)樣品提取效率的影響

為了能夠充分提取樣品中的亞硝酸鹽和硝酸鹽，選用超聲方式提取，分別選擇超聲10 min、15 min、20 min、30 min和40 min，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖所示，在10～20 min內(nèi)，樣品測(cè)定值隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大；20 min后，亞硝酸鹽測(cè)定值趨于穩(wěn)定。而對(duì)于硝酸鹽，25 min后趨于穩(wěn)定，雖然40 min處略有增大，但是從總體趨勢(shì)看，兩者提取效率變化不大。因此，為了加快前處理速度，節(jié)約時(shí)間，設(shè)定超聲時(shí)間為25 min。

2.4 樣品沉淀疏水化合物試劑選擇

乳制品中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、有機(jī)酸和無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)，簡(jiǎn)單溶劑提取無(wú)法將這些干擾物質(zhì)完全去除。因此，需要能沉淀疏水化合物的試劑。常用的試劑有亞鐵氰化鉀和乙酸鋅、乙腈、乙酸等。用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑會(huì)帶入金屬離子，損壞離子色譜柱；對(duì)比乙腈和乙酸試劑，見(jiàn)圖3，由圖3 可知，乙腈在后續(xù)的固相萃取小柱凈化樣品過(guò)程中，易將雜質(zhì)物質(zhì)洗脫下來(lái)，干擾亞硝酸鹽出峰。用乙酸作為沉淀蛋白試劑，無(wú)論是電導(dǎo)法還是紫外法，待測(cè)離子與雜質(zhì)的分離度較好。結(jié)果表明，在提取液中加入3.00%乙酸既能夠沉淀蛋白質(zhì)等有機(jī)物，不損壞色譜柱，也不會(huì)將雜質(zhì)洗脫下來(lái)。

2.5 前處理小柱的優(yōu)化

樣品經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)沉淀后，還含有殘留蛋白質(zhì)、脂肪等疏水性大分子，會(huì)影響分離結(jié)果，污染色譜柱從而縮短色譜柱使用壽命。當(dāng)采用電導(dǎo)檢測(cè)器時(shí)，樣品中含有較高濃度的氯離子，亞硝酸鹽在陰離子柱上的保留時(shí)間靠近氯離子，而樣品中亞硝酸鹽濃度較低，高濃度的氯離子可能干擾亞硝酸鹽的分離和測(cè)定；用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，高濃度的氯離子會(huì)改變低濃度亞硝酸離子的保留時(shí)間?？刹捎肁 g 柱除氯離子。本試驗(yàn)采用了先離心沉淀后，再選擇C18固相萃取柱或超濾杯去除疏水性化合物，結(jié)果表明，兩種方法均可去除溶液中殘留的有機(jī)化合物，但過(guò)超濾杯后樣品肉眼可見(jiàn)渾濁，殘留蛋白質(zhì)等疏水性化合物去除不干凈，容易過(guò)載。經(jīng)試驗(yàn)，C18固相萃取柱回收率好，洗脫液無(wú)可見(jiàn)雜質(zhì)，且價(jià)格合理。因此，選擇C18固相萃取柱和Ag柱串聯(lián)。

表1 檢出限及線性參數(shù)

圖3 不同檢測(cè)器下乙酸和乙腈沉淀蛋白效果譜圖

圖4 IC-CD 樣品譜圖及加標(biāo)譜圖

2.6 線性方程和檢出限

取亞硝酸鹽與硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，逐級(jí)用超純水稀釋，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，按照試驗(yàn)部分的儀器工作條件進(jìn)行測(cè)試，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積和濃度繪制工作曲線。得到IC-CD法和IC-UV法標(biāo)準(zhǔn)曲線。亞硝酸鹽和硝酸鹽的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限（3S/N）見(jiàn)表1。

2.7 IC-CD 和IC-UV 檢 測(cè)方法對(duì)比

選用3.00%的乙酸作為沉淀蛋白質(zhì)試劑。在優(yōu)化的前處理及色譜條件下，選用電導(dǎo)檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器，對(duì)奶粉樣品進(jìn)行色譜分析，并進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。由表1，2可知，兩種方法的加標(biāo)回收率均能夠達(dá)到要求，但電導(dǎo)檢測(cè)器的檢出限優(yōu)于紫外檢測(cè)器。由圖4和圖5可知，因前處理過(guò)程中加入了乙酸，IC-CD法中乙酸和氯離子會(huì)影響到亞硝酸離子出峰，且在基質(zhì)復(fù)雜情況，IC-UV法的雜峰出峰較少。

表2 樣品中陰離子的精密度和加標(biāo)回收率結(jié)果（n=6）

圖5 IC-UV 樣品譜圖及加標(biāo)譜圖

3 小結(jié)

本試驗(yàn)分別采用I C-C D 和IC-UV測(cè)定乳制品中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量。經(jīng)測(cè)試，IC-CD法雖檢出限低，但在實(shí)際樣品測(cè)定中，亞硝酸離子易受氯離子和乙酸離子影響。IC-UV法在基質(zhì)較復(fù)雜情況下雜峰響應(yīng)低或無(wú)響應(yīng)，可避免氯離子對(duì)亞硝酸離子干擾，但檢出限相對(duì)較高，且需要配備紫外檢測(cè)器。兩種方法各有優(yōu)劣，可根據(jù)實(shí)際需要自行選擇。