高效液相色譜-熒光檢測法快速檢測植物油中的辣椒素和二氫辣椒素

吳 娟，湯見平，薛元強(qiáng)，嚴(yán)中和，胡志雄，3，齊玉堂，3，張維農(nóng)，3

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023; 2.中糧新沙糧油工業(yè)(東莞)有限公司，廣東 東莞 523147； 3.湖北省油脂精細(xì)化工工程技術(shù)研究中心，武漢 430023)

辣椒素和二氫辣椒素是辣椒中的活性成分，占總辣椒堿的90%以上，是辣椒中辣味的主要來源[1-2]。由于飲食習(xí)慣及口味愛好，辣椒在我國使用量較大，使用范圍較廣。正常食用植物油中不存在辣椒素或二氫辣椒素，然而接觸過辣椒的餐廚廢棄油脂難以避免地含有這類成分，因此辣椒堿類成分可作為鑒別餐廚廢棄油脂的特征指標(biāo)[3]，相關(guān)的檢測方法亦受到廣泛關(guān)注。

目前，對于植物油中辣椒素、二氫辣椒素的檢測方法主要有高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫分析法和基于光譜技術(shù)的檢測方法等。趙琴[4]、趙燦方[5]、梁桂娟[6]、Wang[7]等建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測食用油和地溝油中的辣椒素和二氫辣椒素的方法，將樣品預(yù)處理后，經(jīng)過固相萃取柱富集辣椒堿，再用解吸液洗脫，然后用高效液相色譜分離目標(biāo)物，并串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。免疫分析法主要有時(shí)間分辨熒光免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金法。楊青青[8]建立了一種辣椒素物質(zhì)時(shí)間免疫層析分析方法；李培武等[9]提供了辣椒素人工半抗原、人工抗原的制備方法，由此得到的人工抗原可免疫獲得親和力高、靈敏度高、特異性強(qiáng)的辣椒素抗體，可用于食用植物油中辣椒素的免疫檢測。Liu等[10]建立了一種表面增強(qiáng)共振拉曼散射方法來檢測辣椒素，并通過分子衍生化處理來識別非法食用油。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測辣椒素有很高的靈敏度，但是儀器昂貴，需要專業(yè)的技術(shù)人員操作和維護(hù)，一般油脂企業(yè)和實(shí)驗(yàn)室無力裝備。免疫分析法和基于光譜技術(shù)的檢測方法效率較高，但是免疫分析法中辣椒素抗原的制備較為困難，基于光譜技術(shù)的檢測方法靈敏度相對較低。因此，建立一種檢出限低、操作簡便且成本低的檢測方法尤為重要。本文依據(jù)辣椒素和二氫辣椒素分子結(jié)構(gòu)中均含有酚羥基，利用相似相溶原理，選擇甲醇為萃取溶劑一步萃取植物油中的辣椒素和二氫辣椒素，并優(yōu)化前處理?xiàng)l件，建立了一種高效液相色譜-熒光檢測方法。該方法能在一定程度上降低檢測成本。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

實(shí)驗(yàn)用植物油，購于當(dāng)?shù)爻?；辣椒?98%)、二氫辣椒素(98%)，百靈威科技有限公司；色譜級甲醇、乙腈、乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HJ-4型多頭磁力加熱攪拌器，金壇市榮華儀器制造有限公司；YRE2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水泵，上海亞榮生化儀器廠；JHX280H旋渦混合儀，北京京輝凱業(yè)科技有限公司；SB3200型超聲雙頻清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)，美國瓦里安儀器有限公司；1260型安捷倫高效液相色譜儀(配G1311C四元泵、G1321B熒光檢測器、G1316A柱溫箱)，安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

取30 g油樣(精確到0.01 g)于100 mL離心管中，加入一定量的萃取溶劑，在磁力攪拌器上萃取一定時(shí)間后，以3 000 r/min離心5 min。取上層澄清溶液(若非萃取1次，可將離心后的沉淀于上述相同條件下萃取、離心，合并上層澄清溶液)于圓底燒瓶中，在40℃下旋蒸濃縮至干。然后用2 mL萃取溶劑復(fù)溶，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)高效液相色譜儀檢測。

1.2.2 高效液相色譜檢測條件

VenusilASB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為甲醇-超純水(體積比70∶30)，流速0.7 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL；激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長312 nm。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以甲醇為溶劑，分別配制0.125、0.250、0.500、1.000、2.500 mg/L辣椒素、二氫辣椒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.2條件進(jìn)行高效液相色譜-熒光檢測。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出辣椒素、二氫辣椒素的線性回歸方程。

1.2.3.2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

分別在空白油樣中加入不同量的辣椒素與二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成12.5、25.0、50.0 μg/kg 3種不同含量的混標(biāo)加標(biāo)油樣，按照優(yōu)化的樣品前處理方法萃取樣品中的辣椒素和二氫辣椒素，然后采用高效液相色譜儀檢測，根據(jù)測得的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別配制80.0、50.0、12.5 μg/L 3種不同質(zhì)量濃度的辣椒素與二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在同一天采用高效液相色譜儀測定5次，連續(xù)測定5 d。根據(jù)測得的峰面積，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算后評價(jià)實(shí)驗(yàn)的精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

以辣椒素和二氫辣椒素加標(biāo)后含量均為100 μg/kg的30 g油樣為樣品，對其前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，每組優(yōu)化選擇均進(jìn)行兩次平行實(shí)驗(yàn)。

2.1.1 萃取溶劑的選擇

分別以甲醇、乙腈、乙醇為萃取溶劑，在萃取溶劑體積30 mL、萃取次數(shù)1次、萃取時(shí)間10 min條件下，考察不同萃取溶劑對辣椒素、二氫辣椒素回收率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 萃取溶劑種類對回收率的影響

由圖1可知，甲醇作為萃取溶劑時(shí)，辣椒素和二氫辣椒素的回收率分別為85.83%、80.52%，乙腈萃取時(shí)辣椒素和二氫辣椒素的回收率分別為71.54% 和65.97%，乙醇萃取時(shí)辣椒素和二氫辣椒素的回收率分別為61.63%和61.59%，可見甲醇萃取回收率最高。因此，選擇萃取溶劑為甲醇。

2.1.2 萃取溶劑體積的確定

在甲醇為萃取溶劑、萃取次數(shù)1次、萃取時(shí)間10 min條件下，加入不同體積的萃取溶劑進(jìn)行萃取，考察萃取溶劑體積對萃取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 萃取溶劑體積對萃取效果的影響

由圖2可知，隨著萃取溶劑體積的增加，辣椒素和二氫辣椒素的峰面積也逐漸增加，當(dāng)萃取溶劑體積增加到30 mL時(shí)，辣椒素和二氫辣椒素的峰面積趨于平穩(wěn)?？紤]到使用100 mL離心管的便捷性，以及樣品檢測時(shí)不必要的損耗，選擇最佳萃取溶劑體積為30 mL。

2.1.3 萃取次數(shù)的確定

在甲醇為萃取溶劑、萃取溶劑體積30 mL、萃取時(shí)間10 min條件下，分別萃取不同次數(shù)，考察萃取次數(shù)對萃取效果的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，萃取次數(shù)由1次增加到2次，辣椒素與二氫辣椒素的峰面積變化較為顯著，約增加了10%，而繼續(xù)增加萃取次數(shù)，辣椒素與二氫辣椒素峰面積變化不大?？紤]到檢測效率，選擇最佳萃取次數(shù)為2次。

圖3 萃取次數(shù)對萃取效果的影響

2.1.4 萃取時(shí)間的確定

在甲醇為萃取溶劑、萃取溶劑體積30 mL條件下，萃取不同時(shí)間，再重復(fù)萃取1次，考察萃取時(shí)間對萃取效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 萃取時(shí)間對萃取效果的影響

由圖4可知，萃取時(shí)間由5 min延長到10 min，辣椒素與二氫辣椒素的峰面積稍有增加，約增加了1.5%，隨著萃取時(shí)間的繼續(xù)延長，辣椒素與二氫辣椒素的峰面積變化不大。從盡可能提高樣品中辣椒素、二氫辣椒素萃取率角度出發(fā)，選擇10 min作為最佳萃取時(shí)間。

綜上，樣品前處理優(yōu)化條件為：油樣30 g，甲醇為萃取溶劑，萃取溶劑體積30 mL，萃取時(shí)間10 min，萃取次數(shù)2次。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.2.3.1方法，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

由表1可知，在0.125～2.500 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，辣椒素與二氫辣椒素的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明線性關(guān)系良好。此外，以3倍信噪比計(jì)算得到辣椒素與二氫辣椒素的檢出限均為5 μg/kg，而地溝油中辣椒堿的含量一般高于600 μg/kg[11]，因此該方法可以應(yīng)用于地溝油的檢測。

2.2.2 加標(biāo)回收率

按1.2.3.2方法，考察樣品加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知：3種加標(biāo)樣品辣椒素的回收率在81.08%～96.80%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.02%～11.00%之間；二氫辣椒素的3種加標(biāo)樣品的回收率在99.27%～100.28%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.26%～7.72%之間。

2.2.3 精密度

按1.2.3.3方法，考察檢測方法的精密度，日內(nèi)和日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表3、表4。

表3 日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

表4 日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

由表3可知，日內(nèi)辣椒素重復(fù)測量的準(zhǔn)確度在91.12%～97.66%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.18%～1.92%之間，二氫辣椒素的準(zhǔn)確度在95.74%～96.65%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.67%～0.78%之間。由表4可知，連續(xù)5 d辣椒素重復(fù)測量的準(zhǔn)確度在88.27%～96.40%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.61%～2.48%范圍內(nèi)，二氫辣椒素的準(zhǔn)確度在93.66%～97.60%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.55%～5.14%之間。通過對3種不同質(zhì)量濃度辣椒素、二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的日內(nèi)、日間實(shí)驗(yàn)，樣品的準(zhǔn)確度均不低于88.27%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于5.14%，綜合說明該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié) 論

本文結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測，建立了一種植物油中辣椒素和二氫辣椒素的檢測方法。在甲醇為萃取溶劑、萃取溶劑體積30 mL、萃取次數(shù)2次、每次萃取時(shí)間10 min條件下，加標(biāo)樣品回收率均在81.08%以上，辣椒素和二氫辣椒素的檢出限均為5 μg/kg，可以應(yīng)用于食用油或非食用油中辣椒素、二氫辣椒素的檢測，為檢測地溝油提供了一種新方法。