植物組織培養(yǎng)技術(shù)在馬鈴薯上的應用

代欣玉，孫璐

（沈陽工學院，遼寧撫順 113122）

植物組織培養(yǎng)技術(shù)（簡稱“組培技術(shù)”）以植物細胞的全能性為理論基礎(chǔ)，將植物離體的根、莖、葉、花、果實等器官、組織、細胞和原生質(zhì)體于人工可控的無菌條件下，在營養(yǎng)充分、培養(yǎng)條件適應作物生長的人工合成培養(yǎng)基上，使組織或者器官通過培養(yǎng)，發(fā)育成完整植株或者生產(chǎn)出其他高于原有價值的產(chǎn)品。植物組織培養(yǎng)也被稱為“離體培養(yǎng)”或“試管培養(yǎng)”。目前，組培技術(shù)在多種作物上應用，如為優(yōu)化城市內(nèi)園藝植物的綠化面積，常采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)以無性繁殖手段，提升蘭花、迎春花等綠化植物的生長效率，改善城市內(nèi)的綠化狀況；草莓的易感病毒種類頗多，為優(yōu)化草莓栽培品種，通過組培技術(shù)培育草莓脫毒苗，在很大程度上減少病害發(fā)生并培育出多種優(yōu)良品種。物種多樣性是自然發(fā)展的基礎(chǔ)，通過組織培養(yǎng)技術(shù)可以實現(xiàn)對瀕臨滅絕植物的擴繁，從而大量繁殖，保護瀕臨滅絕的植物[1]。

馬鈴薯是在糧食、菜、飼料、工業(yè)原料等方面都有重要用途的兼用型經(jīng)濟作物，且栽培條件不嚴格、抗逆性強、營養(yǎng)物質(zhì)含量高、適應性強，從而成為繼水稻、玉米、小麥之后的第四大糧食作物[2]。隨著我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展，多種不同新型栽培技術(shù)的推廣和應用擴大了馬鈴薯的生產(chǎn)與銷售。其中，組培技術(shù)以單倍體育種、離體擴繁、培育脫毒苗等多種措施，提高了馬鈴薯栽培速率，在傳統(tǒng)培育方法的基礎(chǔ)上，獲得了具有生產(chǎn)速率高、性狀優(yōu)良、無毒的優(yōu)質(zhì)馬鈴薯品種，為馬鈴薯的生產(chǎn)與銷售提供更多可能。本文對現(xiàn)有研究成果進行了總結(jié)，以期為馬鈴薯組織培養(yǎng)研究提供參考。

1 植物組織培養(yǎng)技術(shù)在馬鈴薯上的應用現(xiàn)狀

1.1 在馬鈴薯育種上的應用

植物組織培養(yǎng)通過特有的培養(yǎng)方式，為馬鈴薯育種提供了更多可能，完成了常規(guī)育種不可能實現(xiàn)的目標和任務，比如在育種過程中，縮短育種周期從而加快育種進程，達到傳統(tǒng)培育方法難以實現(xiàn)的速度；可同時選擇多種具有優(yōu)良性狀的野生品種進行育種，從而克服育種周期性退化問題，培育出同時具有多種優(yōu)良性狀并可穩(wěn)定遺傳的純系馬鈴薯品種；實現(xiàn)對馬鈴薯優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的篩選和瀕危品種的保存，維持馬鈴薯種質(zhì)資源的多樣性[3]。在馬鈴薯的育種過程中，用秋水仙素處理經(jīng)過花粉、花藥誘導形成的單倍體植株，使染色體加倍即可得到后代不分離同源二倍體的純合系，這就可以直接對雜種一代親本或性狀純合的常規(guī)品種進行下一步的選育。依據(jù)花粉、花藥培育的單倍體育種方法，在馬鈴薯的育種過程中，可以較常規(guī)育種更加快速、準確地得到馬鈴薯的純系，這就加速了馬鈴薯育種的進程，提高了馬鈴薯的品質(zhì)，從而有利于馬鈴薯的生產(chǎn)培育與市場銷售。

連年種植馬鈴薯會引起品種感染病毒從而發(fā)生退化，此時的感病馬鈴薯必須經(jīng)過莖尖脫毒法去除病毒后再生產(chǎn)。姜超[4]通過在MS 培養(yǎng)基中加入不同濃度配比的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)以防止彩色馬鈴薯褐變，經(jīng)過對比篩選最優(yōu)配置方案，從而建立了彩色馬鈴薯莖尖脫毒組培再生體系，為彩色馬鈴薯新品系幼苗抗旱性鑒定提供脫毒組培苗。

1.2 在馬鈴薯離體快繁上的應用

植物離體快繁技術(shù)（微型繁殖）是植物組織培養(yǎng)手段中效果最好、應用范圍最廣的一項技術(shù)[5]。植物組織離體快繁培養(yǎng)不受地域和季節(jié)條件的限制，在人為可控的培養(yǎng)環(huán)境中，繁殖速度快，比普通的田間育種方法要快萬倍甚至數(shù)十萬倍，為農(nóng)作物的選育開辟了新的途徑。

馬鈴薯為無性繁殖，一般情況下是將馬鈴薯雜合型植株用于田間生產(chǎn)，馬鈴薯種子繁殖的后代會因為出現(xiàn)不同程度的變異，從而很難維持馬鈴薯原種的優(yōu)良性狀[6]，繁殖率不高，多代繁殖以后容易出現(xiàn)病蟲害，影響馬鈴薯的品質(zhì)。相比于常規(guī)育種方法，馬鈴薯離體快繁技術(shù)可以有效解決這些在生產(chǎn)栽培中可能產(chǎn)生的不利結(jié)果，通過離體快繁培育出健壯、優(yōu)良、脫毒的種薯，能夠保證在短時間內(nèi)獲得品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)豐富、感官品質(zhì)優(yōu)異的馬鈴薯品種。

1.3 在馬鈴薯脫毒苗培育上的應用

在馬鈴薯的連年栽培中，由于馬鈴薯的無性繁殖方式，導致病蟲害的侵染與病毒的長期積累，并通過種薯遺傳給子代植株，再經(jīng)過受害過程中蚜蟲等媒介的傳播擴大，引起馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此馬鈴薯脫毒苗的培育成為解決此問題的關(guān)鍵。目前應用廣泛的馬鈴薯脫毒技術(shù)主要包括莖尖分生組織培養(yǎng)、熱療法、電療法、化學療法、冷凍療法等[7]。

1.3.1 莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)

莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)技術(shù)是應用范圍最廣的一種脫毒手段。在細胞分裂旺盛的分生組織，由于細胞分裂已經(jīng)消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導致在病毒的復制過程中得不到足夠的營養(yǎng)物質(zhì)而受到抑制，難以進行；分生組織中沒有維管束系統(tǒng)供植物體內(nèi)的病毒移動，病毒僅可以依靠胞間連絲緩慢移動，因此，莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)利用植物分生組織不含病毒的原理，將分生組織從植物體內(nèi)分離出來，進行組培并獲得脫毒苗。

莖尖脫毒技術(shù)的脫毒率高、速度快，但同時也存在局限性。如對莖尖大小的要求較嚴格，莖尖越小脫毒效果越好；對材料營養(yǎng)狀況要求較高，但因莖尖體積小，內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)及水分含量極低，影響脫毒苗正常的生長發(fā)育；對剝離技術(shù)要求嚴格。近年來，馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)的研究重點集中在對不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的莖尖脫毒培養(yǎng)基配方及莖尖的剝離方式上，且多專注于脫毒莖尖成活率提高上。徐燕等[8]利用莖尖脫毒技術(shù)以馬鈴薯為材料進行了多個對比試驗，研究得出該方法是不同激素配比下馬鈴薯出苗率高、污染率低的最佳培養(yǎng)配方。

1.3.2 熱療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

熱療法是在不損傷植物組織的前提下，使植物病毒蛋白質(zhì)外殼受熱變性，通過對病毒向分生組織細胞運動的預防、抑制病毒復制、以及降解病毒RNA 等方式來實現(xiàn)植物脫毒。熱療溫度和持續(xù)時間是影響熱療法進程的重要因素；熱療法具有方法簡單、效果明顯的優(yōu)點，但在去除病毒方面有局限，只對圓形、線狀病毒有效，而對桿狀病毒無效；植物材料耐熱能力差，極易在熱療過程中過熱枯死，只有小部分植株可以存活下來；在鈍化病毒的同時，植物組織內(nèi)的抗性因子也有可能因鈍化而降低脫毒效果。

熱療法對馬鈴薯卷葉病毒最敏感，同時對其他馬鈴薯病毒，如PVX、PVS 等也有不同程度的抑制作用，熱療法常與莖尖分生組織培養(yǎng)同時進行，共同作用，可以顯著提升脫毒效果。尹明華等[9]通過采用莖尖培養(yǎng)與熱療法對6 種不同馬鈴薯病毒交替進行處理，通過對比研究與分析，成功脫除了懷玉山高山馬鈴薯的PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV 病毒。

1.3.3 電療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

電療法是將植物組織如馬鈴薯莖尖、莖段、芽等外植體，持續(xù)通5～100 mA 電流5～25 min，感染的病毒在電脈沖加熱的條件下，核酸變性，失去毒性從而達到脫毒的效果，脫毒后移入培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。電療法不影響外植體再生，同時還具有高效率、操作簡便、快速脫毒等優(yōu)點。胡國君等[10]指出電療法在1996 年首次被應用于對馬鈴薯不同感病類型的全面而系統(tǒng)的脫毒試驗。目前，此方法在國外應用較為廣泛，國內(nèi)應用較少，科研工作者已利用此技術(shù)成功脫除了PVX、PVY、PLRV、PVA、PSTVd等多種病毒。

1.3.4 冷凍療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

冷凍療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)的原理是超低溫對細胞的選擇破壞性，由于莖尖細胞內(nèi)的水分含量高，因此在冰凍條件下，含有病毒的莖尖細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸ВS后即被崩解殺死，由此實現(xiàn)對胞質(zhì)濃度高、可抵抗冰凍環(huán)境、病毒含量少的分生組織細胞進行保存，在此基礎(chǔ)上結(jié)合組培技術(shù)培育出馬鈴薯無毒種苗。相比莖尖脫毒技術(shù)，冷凍療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)更高效便捷、易操作，因此該方法在多種馬鈴薯病毒的脫毒培育中效果顯著[11]。

與傳統(tǒng)脫毒方法相比，冷凍法在脫毒進程中對試驗材料的尺寸大小沒有要求，具有操作簡單、脫毒率高、速度快、成本低等優(yōu)點，可以用于馬鈴薯等其他作物的大量生產(chǎn)。但冷凍療法在目前的應用中還存在著有待攻克的難題，如在低溫保存和冷凍脫毒的過程中，經(jīng)低溫處理后的莖尖，其存活率和再生率降低，造成損失。因此，冷凍保護劑的創(chuàng)新是以后冷凍脫毒法研究中的重點。王彪[12]以“紫花白”馬鈴薯莖尖為材料進行試驗，將其置于超低溫環(huán)境中培養(yǎng)，并與德國馬鈴薯超低溫庫應用的DMSO 滴凍法進行比較，得出超低溫保存的馬鈴薯莖尖再生率更高且可有效脫除PLRV 和PVY 病毒。目前，國內(nèi)外科學家已采用馬鈴薯冷凍療法脫毒技術(shù)成功高效脫除了PVM、PVX、PVY、PVS、PLRV 等病毒。

2 馬鈴薯組織培養(yǎng)中常見的污染源及解決措施

2.1 污染源分析

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是在人工培養(yǎng)基上完成的，雖然是在人工可控的無菌環(huán)境中進行的，但出現(xiàn)污染問題也是不可避免的。引起污染的原因有多種，操作過程的任何不嚴謹環(huán)節(jié)都有可能導致組織培養(yǎng)材料被污染，整個培養(yǎng)過程失敗，這些污染的污染源主要有支原體、病毒、真菌、細菌以及不同種細胞的污染，其中最常見的是真菌和細菌[13]。

導致細菌性污染最主要的原因是，在培養(yǎng)過程中，操作人員使用的接種工具消毒不徹底、在操作過程中的行為不規(guī)范、培養(yǎng)材料處理不正確等。細菌性污染導致培養(yǎng)基或馬鈴薯培養(yǎng)材料的表面產(chǎn)生黏液狀雜質(zhì)或菌落，還有可能出現(xiàn)水漬狀混濁或泡沫發(fā)酵狀，這些污染狀況一般在接種的1～2 d 后就可以顯現(xiàn)[14]。在由真菌引起的真菌性污染的培養(yǎng)容器內(nèi)，往往會出現(xiàn)白、黑或綠色的菌絲塊，其中以曲霉、毛霉和青霉屬真菌最常見，由此可見，霉菌通常是真菌性污染的主要源頭。

2.2 污染防治措施

馬鈴薯組培育種過程中的這些污染問題，可以通過有效措施來避免。首先，要對培養(yǎng)基和馬鈴薯組培苗進行部分殺菌消毒，從源頭抑制污染的出現(xiàn)，培養(yǎng)基封口后立即進行高溫高壓滅菌，防止菌類大量滋生；其次，在接種過程中須嚴格遵守操作規(guī)范，確保操作技術(shù)與流程正確無誤，以及對操作工具、設(shè)備進行充分徹底的滅菌消毒。為殺菌徹底，操作過程中滅菌鍋內(nèi)應留有空隙，保證蒸汽流通和熱交換的正常進行；基礎(chǔ)苗在接種之前應仔細篩選，將已經(jīng)被污染、存在被污染隱患的基礎(chǔ)苗及時清除，使用75%酒精擦拭裝有基礎(chǔ)苗的容器瓶身及蓋口，并在超凈工作臺進行紫外燈照射消毒后備用。最后，在馬鈴薯組培苗的生長發(fā)育過程中，需要調(diào)控其生長環(huán)境，將各項指標調(diào)節(jié)至最適合組培苗生長的范圍，保證其健壯生長；安裝完善的消毒殺菌裝置，定期消毒，抑制污染源滋生，使其更有利于馬鈴薯組培苗的無菌生長。

3 展望

我國作為馬鈴薯產(chǎn)量最高的國家，目前已經(jīng)在馬鈴薯主糧化戰(zhàn)役中打響了第一槍。在馬鈴薯脫毒苗的生產(chǎn)過程中，還有很多問題需要解決[15]。首先是脫毒馬鈴薯的研制，簡單易操作、安全效率高、脫毒速度快的脫毒技術(shù)是馬鈴薯實現(xiàn)主糧化必不可少的一部分。而且馬鈴薯品種繁多，易感病毒種類也很多，不同種馬鈴薯受不同類型病毒感染后，其對各種脫毒措施的敏感程度也大不相同，往往需要同時采用兩種或兩種以上脫毒技術(shù)對馬鈴薯進行脫毒處理，多種技術(shù)間取長補短，共同進行病毒防治。脫毒馬鈴薯的經(jīng)濟效益、種植效益遠高于未脫毒馬鈴薯，現(xiàn)階段我國對于馬鈴薯脫毒品種的生產(chǎn)栽培還需進一步的改進與完善，才能獲得更高品質(zhì)的脫毒馬鈴薯品種[16]。其次，組培過程中的污染問題是制約種苗培育的關(guān)鍵因素，目前對于污染的處理不僅有常規(guī)的化學手段，而且還可以利用真空減壓滅菌、磁力攪拌、超聲波振動、混合消毒液等技術(shù)和方法對外植體進行滅菌消毒，且效果明顯；在培養(yǎng)基中加入兩種或兩種以上的抗生素，減少細菌污染源頭，抑制細菌的抗藥性。同時需要解決許多問題，如組培材料滅菌不徹底、抗生素性能不穩(wěn)定，抗生素易在酸堿條件、加熱條件下分解失活，抗生素成本高，促使研究工作者探索尋找性能穩(wěn)定、耐酸堿、高溫高壓下不易分解的抑菌劑，從而解決組培過程中出現(xiàn)的污染問題，便于在以后的研究工作中提高試驗成功率與效率，減少不必要的損失，進一步提升作物品質(zhì)。