紫外-可見分光光度法測(cè)定破壁靈芝孢子粉中總?cè)萍岸嗵呛?/h1>
2020-12-14 04:21:17朱莉徐曉萍黃婷
食品安全導(dǎo)刊·下旬刊 2020年10期
朱莉 徐曉萍 黃婷
摘 要：本文建立了測(cè)定破壁靈芝孢子粉中總?cè)萍岸嗵呛康淖贤?可見分光光度法?？?cè)频馁|(zhì)量濃度在0.8～4.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），方法精密度為1.54%，回收率為88.0%～95.7%。多糖的質(zhì)量濃度在0.4～8.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），方法精密度為1.99%，回收率為93.2%～98.0%。該方法簡(jiǎn)便、可行，可用于測(cè)定破壁靈芝孢子粉中總?cè)萍岸嗵呛俊?/p>
關(guān)鍵詞：破壁靈芝孢子粉;總?cè)?多糖;分光光度法
靈芝孢子是靈芝在生長成熟期從靈芝菌褶中彈射出來的卵形生殖細(xì)胞，它的主要成分包含三萜類、多糖類、氨基酸多肽類、核苷酸與生物堿類等，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖血脂和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。靈芝孢子為雙層細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，質(zhì)地堅(jiān)韌，極難氧化分解，因此破壁處理后的靈芝孢子粉更有利于機(jī)體對(duì)孢內(nèi)有效物質(zhì)的消化吸收[4]?？焖贉y(cè)定靈芝孢子粉中所含有效活性成分具有重要意義，本文采用紫外-可見分光光度法測(cè)定破壁靈芝孢子粉中的總?cè)萍岸嗵呛?，并?duì)測(cè)定方法的精密度、重復(fù)性及檢出限進(jìn)行驗(yàn)證。
1 材料
1.1 主要試劑
無水乙醇、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、香草醛、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、硫酸銅、無水硫酸鈉統(tǒng)一枸櫞酸鈉;標(biāo)準(zhǔn)品：齊墩果酸（1339），購于NATURE STANDARD公司;葡聚糖（S14110-100 g，Mw：1×105 g/mol），購于上海源葉生物科技有限公司。
1.2 儀器
Cary50紫外-可見分光光度計(jì)（美國瓦里安），EL204分析天平（上海菁海有限公司），KQ-400KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MTN-2800W氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器），SC-3610低速離心機(jī)（安徽中科中佳）。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 總?cè)坪繙y(cè)定
稱取破壁靈芝孢子粉顆粒約0.2 g，置于100 mL容量瓶中，加入60 mL無水乙醇，水浴超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）45 min后，冷卻至室溫后，用無水乙醇定容，搖勻后過濾，吸取過濾液0.20 mL于10 mL具塞比色管中，氮吹使溶劑完全揮發(fā)。加入新配置的5%香草醛-冰乙酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。置于70 ℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min。加乙酸乙酯4.00 mL稀釋，搖勻，在546 nm波長下測(cè)定吸光度。
2.2 多糖含量測(cè)定
稱取破壁靈芝孢子粉顆粒5.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加水80 mL左右，攪拌加熱回流1 h，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻后過濾。準(zhǔn)確吸取過濾液5.0 mL，置于50 mL離心管中，加入無水乙醇20 mL，混勻5 min后，以3 000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘?jiān)?0%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?.0 mL。準(zhǔn)確吸取終溶液2.0 mL，置于50 mL離心管中，加入100 g/L氫氧化鈉溶液2.0 mL、銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷卻，以6 000 r/min離心10 min，棄去上清液。殘?jiān)孟礈煲簲?shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)?0%硫酸溶液2.0 mL溶解洗滌并轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，加水稀釋至刻度，混勻，準(zhǔn)確吸取樣品測(cè)定液2.0 mL，置于25 mL比色管中，加入50 g/L苯酚溶液
1.0 mL，在渦旋混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，渦旋混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫，在485 nm波長下測(cè)定吸光度待測(cè)。
3 結(jié)果與分析
3.1 波長選擇
分別移取0.50 mL齊墩果酸對(duì)照品溶液（0.20 mg/mL）和2.00 mL葡聚糖對(duì)照品溶液（0.10 mg/mL）至25 mL具塞比色管中，處理顯色后在紫外-可見分光光度計(jì)400～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)總?cè)圃?46 nm波長下吸光度最佳，多糖在485 nm波長下吸光度最佳。
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
分別移取齊墩果酸對(duì)照品溶液（0.20 mg/mL）0.10、0.20、0.30、0.40 mL和0.50 mL于25 mL具塞比色管中，葡聚糖對(duì)照品溶液（0.10 mg/mL）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50 mL和2.00 mL于25 mL比色管中，處理顯色后再分別以試劑空白做參比，在546 nm和485 nm波長下測(cè)定吸光度值，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到總?cè)凭€性回歸方程y=0.262 4x-0.014 3，R2=0.999 7，質(zhì)量濃度范圍0.8～4.0 μg/mL;多糖線性回歸方程y=0.129 4x-0.013，R2=0.999 9，質(zhì)量濃度范圍0.4～8.0 μg/mL。
3.3 精密度試驗(yàn)
分別移取7份0.3 mL齊墩果酸對(duì)照品溶液（0.20 mg/mL）和0.6 mL葡聚糖對(duì)照品溶液（0.10 mg/mL），依照方法測(cè)定吸光度，計(jì)算7次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示總?cè)芌SD為1.54%，多糖RSD為1.99%，表明該方法的精密度良好。
3.4 重復(fù)性試驗(yàn)
分別平行稱取7份破壁靈芝孢子粉顆粒0.2 g用于總?cè)频闹貜?fù)性試驗(yàn)，5.0 g用于多糖的重復(fù)性試驗(yàn)，依照方法測(cè)定吸光度，計(jì)算7次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示總?cè)芌SD為1.91%，多糖RSD為2.18%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。
3.5 加標(biāo)回收率
分別取9份已知含量的供試品，對(duì)總?cè)坪投嗵沁M(jìn)行低、中、高3種濃度的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果顯示總?cè)苹厥章蕿?8.0%～95.7%，多糖回收率為93.2%～98.0%，表明該方法的回收率良好。
4 結(jié)論
紫外-可見分光光度法是常見定量方法，因快速、簡(jiǎn)單、性價(jià)比高，且具有一定的穩(wěn)定性和重復(fù)性，因此在中藥質(zhì)量分析中應(yīng)用較多。本試驗(yàn)針對(duì)線性、檢出限、精密度和回收率等進(jìn)行方法驗(yàn)證。結(jié)果表明，總?cè)频馁|(zhì)量濃度在0.8～4.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），方法精密度為1.54%，回收率為88.0%～95.7%。多糖的質(zhì)量濃度在0.4～8.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），方法精密度為1.99%，回收率為93.2%～98.0%。該方法簡(jiǎn)單高效，完全滿足分析方法的要求。
參考文獻(xiàn)
[1]王瑛，金捷，金祖漢，等.靈芝孢子粉增強(qiáng)免疫功能的研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33（5）：544-546.
[2]劉艷榮，黃厚今.靈芝孢子粉功能作用的研究進(jìn)展[J].中國食物與營養(yǎng)，2016，22（4）：65-69.
[3]劉春延，張國財(cái)，程方志，等.靈芝孢子粉破壁工藝優(yōu)化及其抗腫瘤作
用[J].食品科學(xué)，2016，37（14）：51-55.
[4]林志彬，王鵬云.靈芝孢子及其活性成分的藥理研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2006，38（5）：541-546.
朱莉 徐曉萍 黃婷
摘 要：本文建立了測(cè)定破壁靈芝孢子粉中總?cè)萍岸嗵呛康淖贤?可見分光光度法?？?cè)频馁|(zhì)量濃度在0.8～4.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），方法精密度為1.54%，回收率為88.0%～95.7%。多糖的質(zhì)量濃度在0.4～8.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），方法精密度為1.99%，回收率為93.2%～98.0%。該方法簡(jiǎn)便、可行，可用于測(cè)定破壁靈芝孢子粉中總?cè)萍岸嗵呛俊?/p>
關(guān)鍵詞：破壁靈芝孢子粉;總?cè)?多糖;分光光度法
靈芝孢子是靈芝在生長成熟期從靈芝菌褶中彈射出來的卵形生殖細(xì)胞，它的主要成分包含三萜類、多糖類、氨基酸多肽類、核苷酸與生物堿類等，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖血脂和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。靈芝孢子為雙層細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，質(zhì)地堅(jiān)韌，極難氧化分解，因此破壁處理后的靈芝孢子粉更有利于機(jī)體對(duì)孢內(nèi)有效物質(zhì)的消化吸收[4]?？焖贉y(cè)定靈芝孢子粉中所含有效活性成分具有重要意義，本文采用紫外-可見分光光度法測(cè)定破壁靈芝孢子粉中的總?cè)萍岸嗵呛?，并?duì)測(cè)定方法的精密度、重復(fù)性及檢出限進(jìn)行驗(yàn)證。
1 材料
1.1 主要試劑
無水乙醇、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、香草醛、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、硫酸銅、無水硫酸鈉統(tǒng)一枸櫞酸鈉;標(biāo)準(zhǔn)品：齊墩果酸（1339），購于NATURE STANDARD公司;葡聚糖（S14110-100 g，Mw：1×105 g/mol），購于上海源葉生物科技有限公司。
1.2 儀器
Cary50紫外-可見分光光度計(jì)（美國瓦里安），EL204分析天平（上海菁海有限公司），KQ-400KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MTN-2800W氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器），SC-3610低速離心機(jī)（安徽中科中佳）。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 總?cè)坪繙y(cè)定
稱取破壁靈芝孢子粉顆粒約0.2 g，置于100 mL容量瓶中，加入60 mL無水乙醇，水浴超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）45 min后，冷卻至室溫后，用無水乙醇定容，搖勻后過濾，吸取過濾液0.20 mL于10 mL具塞比色管中，氮吹使溶劑完全揮發(fā)。加入新配置的5%香草醛-冰乙酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。置于70 ℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min。加乙酸乙酯4.00 mL稀釋，搖勻，在546 nm波長下測(cè)定吸光度。
2.2 多糖含量測(cè)定
稱取破壁靈芝孢子粉顆粒5.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加水80 mL左右，攪拌加熱回流1 h，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻后過濾。準(zhǔn)確吸取過濾液5.0 mL，置于50 mL離心管中，加入無水乙醇20 mL，混勻5 min后，以3 000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘?jiān)?0%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?.0 mL。準(zhǔn)確吸取終溶液2.0 mL，置于50 mL離心管中，加入100 g/L氫氧化鈉溶液2.0 mL、銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷卻，以6 000 r/min離心10 min，棄去上清液。殘?jiān)孟礈煲簲?shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)?0%硫酸溶液2.0 mL溶解洗滌并轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，加水稀釋至刻度，混勻，準(zhǔn)確吸取樣品測(cè)定液2.0 mL，置于25 mL比色管中，加入50 g/L苯酚溶液
1.0 mL，在渦旋混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，渦旋混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫，在485 nm波長下測(cè)定吸光度待測(cè)。
3 結(jié)果與分析
3.1 波長選擇
分別移取0.50 mL齊墩果酸對(duì)照品溶液（0.20 mg/mL）和2.00 mL葡聚糖對(duì)照品溶液（0.10 mg/mL）至25 mL具塞比色管中，處理顯色后在紫外-可見分光光度計(jì)400～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)總?cè)圃?46 nm波長下吸光度最佳，多糖在485 nm波長下吸光度最佳。
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
分別移取齊墩果酸對(duì)照品溶液（0.20 mg/mL）0.10、0.20、0.30、0.40 mL和0.50 mL于25 mL具塞比色管中，葡聚糖對(duì)照品溶液（0.10 mg/mL）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50 mL和2.00 mL于25 mL比色管中，處理顯色后再分別以試劑空白做參比，在546 nm和485 nm波長下測(cè)定吸光度值，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到總?cè)凭€性回歸方程y=0.262 4x-0.014 3，R2=0.999 7，質(zhì)量濃度范圍0.8～4.0 μg/mL;多糖線性回歸方程y=0.129 4x-0.013，R2=0.999 9，質(zhì)量濃度范圍0.4～8.0 μg/mL。
3.3 精密度試驗(yàn)
分別移取7份0.3 mL齊墩果酸對(duì)照品溶液（0.20 mg/mL）和0.6 mL葡聚糖對(duì)照品溶液（0.10 mg/mL），依照方法測(cè)定吸光度，計(jì)算7次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示總?cè)芌SD為1.54%，多糖RSD為1.99%，表明該方法的精密度良好。
3.4 重復(fù)性試驗(yàn)
分別平行稱取7份破壁靈芝孢子粉顆粒0.2 g用于總?cè)频闹貜?fù)性試驗(yàn)，5.0 g用于多糖的重復(fù)性試驗(yàn)，依照方法測(cè)定吸光度，計(jì)算7次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示總?cè)芌SD為1.91%，多糖RSD為2.18%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。
3.5 加標(biāo)回收率
分別取9份已知含量的供試品，對(duì)總?cè)坪投嗵沁M(jìn)行低、中、高3種濃度的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果顯示總?cè)苹厥章蕿?8.0%～95.7%，多糖回收率為93.2%～98.0%，表明該方法的回收率良好。
4 結(jié)論
紫外-可見分光光度法是常見定量方法，因快速、簡(jiǎn)單、性價(jià)比高，且具有一定的穩(wěn)定性和重復(fù)性，因此在中藥質(zhì)量分析中應(yīng)用較多。本試驗(yàn)針對(duì)線性、檢出限、精密度和回收率等進(jìn)行方法驗(yàn)證。結(jié)果表明，總?cè)频馁|(zhì)量濃度在0.8～4.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），方法精密度為1.54%，回收率為88.0%～95.7%。多糖的質(zhì)量濃度在0.4～8.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），方法精密度為1.99%，回收率為93.2%～98.0%。該方法簡(jiǎn)單高效，完全滿足分析方法的要求。
參考文獻(xiàn)
[1]王瑛，金捷，金祖漢，等.靈芝孢子粉增強(qiáng)免疫功能的研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33（5）：544-546.
[2]劉艷榮，黃厚今.靈芝孢子粉功能作用的研究進(jìn)展[J].中國食物與營養(yǎng)，2016，22（4）：65-69.
[3]劉春延，張國財(cái)，程方志，等.靈芝孢子粉破壁工藝優(yōu)化及其抗腫瘤作
用[J].食品科學(xué)，2016，37（14）：51-55.
[4]林志彬，王鵬云.靈芝孢子及其活性成分的藥理研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2006，38（5）：541-546.
