胎膜TRAIL表達(dá)水平及血液相關(guān)炎性標(biāo)志物水平在胎膜早破發(fā)生中的作用與關(guān)系

吳兆晴 玉姣 李曉瓊 周文麗 張曙萱

[摘要] 目的 探討胎膜中腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體（TRAIL）水平與血清炎性標(biāo)志物水平在胎膜早破發(fā)病機(jī)制中的作用及關(guān)系。 方法 選取2019年1—12月江蘇省淮安市婦幼保健院收住的80例胎膜早破產(chǎn)婦為研究對象，根據(jù)破膜孕齡將其分為足月胎膜早破組（孕齡≥37周，46例）、早產(chǎn)胎膜早破組（孕齡28～36+6周，34例）。選取同期80名足月胎膜完整產(chǎn)婦作為對照組。檢測三組胎膜組織中TRAIL及血液中相關(guān)炎性標(biāo)志物水平[中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值（NLR）、血小板淋巴細(xì)胞比值（PLR）及淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞比值（LMR）]并分析胎膜組織中TRAIL與炎性標(biāo)志物水平相關(guān)性。 結(jié)果 早產(chǎn)胎膜早破組TRAIL陽性率，TRAIL mRNA表達(dá)水平，血清NLR、PLR、LMR水平高于足月胎膜早破組及對照組（均P < 0.05）;足月胎膜早破組TRAIL陽性率，TRAIL mRNA表達(dá)水平，血清NLR、PLR、LMR水平高于對照組（均P < 0.05）。胎膜組織中TRAIL表達(dá)水平與血清NLR、PLR、LMR水平呈正相關(guān)（r = 0.543、0.574、0.651，均P < 0.05）。 結(jié)論 TRAIL及血清相關(guān)炎性標(biāo)志物在胎膜早破產(chǎn)婦胎膜中高表達(dá)，二者存在正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 胎膜早破;腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體;中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值;血小板淋巴細(xì)胞比值

[中圖分類號] R714.433? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（c）-0024-04

The role and relationship between the expression level of TRAIL of fetal membranes and the level of blood-related inflammatory markers in the occurrence of premature rupture of membranes

WU Zhaoqing1? ?YANG Yujiao2? ?LI Xiaoqiong2? ?ZHOU Wenli2? ?ZHANG Shuxuan3

1.Department of Obstetrics， Xuzhou Medical University， Huai′an Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangsu Province， Jiangsu Province， Huai′an? ?223002， China; 2.Department of Obstetrics， Huai′an Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangsu Province， Jiangsu Province， Huai′an? ?223002， China; 3.Department of Obstetrics， Xuzhou Municipal Hospital Affiliated to Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou? ?221006， China

[Abstract] Objective To explore the role and relationship between the expression level of tumor necrosis factor-related apoptotic ligand （TRAIL） of membranes and serum inflammatory markers level in the pathogenesis of premature rupture of membranes. Methods From January to December 2019， 80 cases of premature rupture of membranes pregnant women admitted to Huai′an Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangsu Province were selected as the research objects. They were divided into full-term premature rupture of membranes group （gestational age≥ 37 weeks， 46 cases） and preterm premature rupture of membranes group （gestational age 28-36+6 weeks， 34 cases）. 80 pregnant women of full-term fetal membranes were selected as control group in the same period. TRAIL in membranes tissue and blood related inflammatory markers （neutrophil lymphocyte ratio [NLR]， platelet lymphocyte ratio [PLR] and lymphocyte monocyte ratio [LMR]） were measured and the correlation between TRAIL and inflammatory markers in membranes tissue was analyzed. Results The TRAIL positive rate， TRAIL mRNA expression level and serum NLR， PLR， LMR levels in preterm premature rupture of membranes group were higher than those of full-term premature rupture of membranes group and control group（all P < 0.05）， and the TRAIL positive rate， TRAIL mRNA expression level and serum NLR， PLR， LMR levels in full-term premature rupture of membranes group were higher than those of control group （all P < 0.05）. TRAIL expression level in fetal membranes was positively correlated with serum NLR， PLR and LMR levels （r = 0.543， 0.574， 0.651， all P < 0.05）. Conclusion TRAIL and serum-related inflammatory markers are highly expressed in the membranes of women with premature rupture of foetal membranes， and there is a positive correlation between them.

[Key words] Premature rupture of membranes; Tumor necrosis factor-related apoptotic ligand; Neutrophil lymphocyte ratio; Platelet lymphocyte ratio

胎膜早破是圍生期常見合并癥之一，發(fā)病率為2.7%～7.0%[1]，可導(dǎo)致宮內(nèi)感染、早產(chǎn)、胎盤早剝、胎兒窘迫[2]等發(fā)生，嚴(yán)重危害母兒生命健康。其發(fā)生原因及具體機(jī)制仍未完全明確，但是炎癥、細(xì)胞凋亡在這一過程中起著至關(guān)重要的作用[3-4]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡及監(jiān)視免疫反應(yīng)等的作用，在胎膜早破的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用[5-6]。為此，本研究選取了江蘇省淮安市婦幼保健院（以下簡稱“我院”）產(chǎn)科收住的80例胎膜早破產(chǎn)婦，探討胎膜中TRAIL水平與血液炎性標(biāo)志物水平在胎膜早破發(fā)病機(jī)制中的作用?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1-12月我院收住的80例胎膜早破產(chǎn)婦為研究對象，根據(jù)破膜孕齡將其分為足月胎膜早破組（孕齡 ≥37周，46例）、早產(chǎn)胎膜早破組（孕齡28～36+6周，34例），選取同期我院80名足月胎膜完整產(chǎn)婦作為對照組。對照組年齡（27.76±3.52）歲;初產(chǎn)婦65名，經(jīng)產(chǎn)婦15名。足月胎膜早破組年齡（28.05±3.69）歲;初產(chǎn)婦38例，經(jīng)產(chǎn)婦8例。早產(chǎn)胎膜早破組年齡（27.28±4.19）歲;初產(chǎn)婦27例，經(jīng)產(chǎn)婦7例。三組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①胎膜早破符合2015年中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會產(chǎn)科學(xué)組《胎膜早破的診斷與處理指南》標(biāo)準(zhǔn)[7];②胎位正常、單胎妊娠，定期產(chǎn)檢且產(chǎn)檢資料完整，對照組胎膜完整且孕齡≥37周;③對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨產(chǎn)或存在宮縮或存在胎位異常、骨盆狹窄、生殖道感染者;②經(jīng)產(chǎn)婦有胎膜早破、子癇[8]、宮內(nèi)感染、流產(chǎn)、死胎死產(chǎn)等不良妊娠史者;③存在妊娠高血壓綜合征、妊娠糖尿病、瘢痕子宮[9]、前置胎盤、妊娠合并心臟病、胎兒宮內(nèi)窘迫、羊水異常等產(chǎn)科并發(fā)癥、合并癥者;④合并嚴(yán)重臟器功能不全、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等基礎(chǔ)疾病者;⑤既往有吸煙、嗜酒史，妊娠期間有口服藥物史者。

1.2 方法

1.2.1 TRAIL測定? 標(biāo)本采集：取產(chǎn)婦胎膜破口處附近大小為20×20 mm2組織，分為兩份，0.9%氯化鈉溶液沖洗后大頭針固定，一份置入凍存管投入液氮，一份置于10%甲醛溶液中固定。

TRAIL定性：取甲醛溶液固定的標(biāo)本脫水，石蠟包埋，制成3 μm切片，沖洗，一抗為武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供的兔抗人TRAIL抗體，采用免疫組化SP法[10]進(jìn)行檢測。陰性對照為磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗的結(jié)果。

TRAIL mRNA定量：取置入液氮的標(biāo)本，采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法[11]進(jìn)行檢測：Trizol法提取組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時定量PCR，GAPDH為內(nèi)參基因[11]。Trizol法：取1.5 mL EP管將標(biāo)本置入，加入Trizol液1 mL充分勻漿、靜置，加入氯仿0.2 mL，離心（4℃、12 000 g離心15 min）;取上清液加入異丙醇0.5 mL沉淀，再次離心（4℃、12 000 g離心10 min）;棄上清液加入75%酒精1 mL洗滌、離心（4℃、12 000 g離心5 min）;棄上清液加入20 μL H2O溶解RNA。反轉(zhuǎn)錄：提取的RNA作為RNA模板，加入引物合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA單鏈，形成DNA-RNA雜化雙鏈，加入反轉(zhuǎn)錄酶水解為單鏈DNA，以單鏈DNA為模板合成另一條DNA鏈形成雙鏈DNA。引物序列：TRAIL上下游引物序列分別為5′-AGAGGCACCACTAAAAGATCGC-3′和5′-GGTTTC-ACTATGTTGGTCACTATGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物133 bp;MMP-2上下游引物序列分別為5′-TGACGTGGACATCCG-CAAAG-3′和5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物133 bp;GAPDH上下游引物序列分別為5′-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3′和5′-AGGGATG-ATGTTCTGGAGAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物226 bp。由上海生物工程有限公司合成引物。PCR的反應(yīng)條件為95℃ 10 min、95℃ 30 s、60℃ 1 h，35個循環(huán)，重復(fù)3次。

1.2.2 炎性標(biāo)志物測定? 取研究對象入院時外周靜脈血3 mL，血常規(guī)檢測采用全自動血球分析儀（武漢盛世達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號：BC-5000），計算中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值（neutrophil lymphocyte ratio，NLR）、血小板淋巴細(xì)胞比值（platelet lymphocyte ratio，PLR）及淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞比值（lymphocyte monocyte ratio，LMR）。

1.3 TRAIL陽性標(biāo)準(zhǔn)

雙盲法在顯微鏡下進(jìn)行觀察，根據(jù)TRAIL陽性表達(dá)細(xì)胞百分比及顯色深淺綜合判定。陽性標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分，無陽性細(xì)胞、陽性細(xì)胞 <10%、10%～50%、>50%～75%、>75%分別記為0、1、2、3、4分;根據(jù)顯色深淺評分，細(xì)胞無顯色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分;兩項評分的乘積≤3分為陰性，4分為陽性，≥5分為強(qiáng)陽性[12]。陽性率=（陽性+強(qiáng)陽性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗;胎膜組織中TRAIL水平和血清NLR、PLR、LMR水平的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組臨床資料比較

早產(chǎn)胎膜早破組分娩孕齡、新生兒體重、5 min Apgar評分小于足月胎膜早破組、對照組，足月胎膜早破組5 min Apgar評分小于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見表1。

2.2 三組胎膜組織TRAIL表達(dá)情況比較

早產(chǎn)胎膜早破組TRAIL陽性率、TRAIL mRNA表達(dá)水平高于足月胎膜早破組及對照組，足月胎膜早破組TRAIL陽性率、TRAIL mRNA表達(dá)水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見表2。

2.3 三組血清炎性標(biāo)志物水平比較

早產(chǎn)胎膜早破組血清NLR、PLR、LMR水平高于足月胎膜早破組及對照組，足月胎膜早破組血清NLR、PLR、LMR水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見表3。

2.4 胎膜組織中TRAIL水平與血清NLR、PLR、LMR水平的相關(guān)性

胎膜早破產(chǎn)婦胎膜組織中TRAIL水平與血清NLR、PLR、LMR水平呈正相關(guān)（r = 0.543、0.574、0.651，均P < 0.05）。

3 討論

胎膜絨毛膜與羊膜之間的細(xì)胞外基質(zhì)含有豐富的間質(zhì)膠原纖維[13]，可適應(yīng)妊娠期間不斷增大的宮腔壓力。一般而言，結(jié)構(gòu)完整的胎膜是不會破裂的，但炎癥反應(yīng)等多種原因?qū)е录?xì)胞外基質(zhì)膠原代謝失衡，張力不夠，宮腔壓力增大則易形成胎膜早破。研究顯示[14-16]，胎膜早破產(chǎn)婦破口處厚度下降35%，膠原纖維密度下降，結(jié)締組織水腫，導(dǎo)致胎膜應(yīng)力下降、羊膜和絨毛膜分離;膠原大量降解，導(dǎo)致羊膜細(xì)胞脫落、基底膜退化或損傷，而期間羊膜和絨毛膜無法有效重建，炎癥細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致胎膜早破。此過程中，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡起著至關(guān)重要的作用[17]。

TRAIL屬于腫瘤壞死因子家族成員，廣泛表達(dá)于宮頸、卵巢等各種細(xì)胞和組織，可作用于細(xì)胞增殖、分化、凋亡的過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、免疫監(jiān)視等[18]。在穩(wěn)定妊娠期間，TRAIL可有效維護(hù)胎膜的自我環(huán)境。研究顯示[19-20]，妊娠晚期，TRAIL可在一定程度上表達(dá)于胎盤、胎膜，尤其是羊膜腔中。本研究結(jié)果顯示，早產(chǎn)胎膜早破組TRAIL陽性率及TRAIL mRNA表達(dá)水平高于足月胎膜早破組及對照組（均P < 0.05）。提示胎膜早破尤其是早產(chǎn)胎膜早破產(chǎn)婦胎膜中TRAIL存在高表達(dá)，表明TRAIL與胎膜早破密切相關(guān)，其表達(dá)增高可能提示胎膜破裂的發(fā)生，甚至為胎膜早破的發(fā)病機(jī)制之一。其作用機(jī)制可能為TRAIL調(diào)控胎膜組織細(xì)胞的生長、凋亡，其表達(dá)升高，使組織活性細(xì)胞水平下降，影響細(xì)胞外基質(zhì)沉積和膠原纖維合成[21-22]，從而導(dǎo)致胎膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低胎膜韌性、削減胎膜局部組織厚度。

炎癥反應(yīng)是胎膜早破尤其是未足月胎膜早破發(fā)生的重要原因。白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子α等炎癥因子結(jié)合后可引發(fā)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)活性氧、膠原重塑[23-25]，從而影響胎膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其破裂。本研究結(jié)果顯示，早產(chǎn)胎膜早破組血清NLR、PLR、LMR水平高于足月胎膜早破組及對照組（均P < 0.05）。胎膜早破產(chǎn)婦NLR、PLR、LMR水平升高，提示機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)。TRAIL的升高可能與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)。當(dāng)供氧、供血不足時，胎盤、胎膜組織可發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致異常免疫反應(yīng)，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生TRAIL;生殖道感染發(fā)生時，活化中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致大量炎癥因子釋放，由于TRAIL具有監(jiān)視免疫介導(dǎo)應(yīng)答的作用，因此炎癥反應(yīng)發(fā)生誘發(fā)了TRAIL大量升高。本研究結(jié)果顯示，胎膜組織TRAIL表達(dá)水平與血清NLR、PLR、LMR水平呈正相關(guān)。提示炎癥反應(yīng)是TRAIL升高的重要原因，NLR、PLR、LMR、TRAIL均參與胎膜早破發(fā)生。

綜上所述，TRAIL在胎膜早破尤其是早產(chǎn)胎膜早破產(chǎn)婦胎膜中高表達(dá)，與血清炎性標(biāo)志物存在正相關(guān)，二者共同參與了胎膜早破發(fā)生。

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（收稿日期：2020-06-08）

[基金項目] 江蘇省婦幼健康科研項目（F201731）。

[作者簡介] 吳兆晴（1973.9-），女，副主任醫(yī)師;研究方向：母體醫(yī)學(xué)。

[通訊作者] 張曙萱（1973.12-），女，博士，主任醫(yī)師;研究方向：圍生醫(yī)學(xué)。